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분야
docⅡ. 실험 방법 및 과정
Ⅲ. 실험 결과
A. 식이섭취량과 몸무게, 열량효율
B. 변과 장기 무게
C. 헤마토크리트 분석
D. 지질, 콜레스테롤, 단백질의 함량
1. 혈청, 간의 총 지질 함량
2. 혈청, 간의 콜레스테롤 함량
3. 혈청의 단백질 함량
Ⅳ. 고찰
A. 식이섭취량과 몸무게, 열량효율
B. 변과 장기 무게
C. 혈청, 간의 총 지질 함량
D. 혈청, 간의 콜레스테롤 함량
E. 혈청의 단백질 함량
Ⅴ. 결론
Ⅵ. 참고문헌
본 연구에서는 흰쥐를 이용하여 동물실험을 수행하였다. 실험기간 중 물과 식이를 자유채식 하도록 하였다.본 실험에서는 고탄수화물식이군(대조군)과 고지방식이군(실험군)의 두 군으로 나누어 각 군당 6마리씩 총 12마리의 흰 쥐를 사육하고 그 변화를 관찰하였다. 실험 식이는 3월24일부터 4월23일까지 총 31일간 제공하였으며 흰 쥐에게 제공한 실험 식이조성은 Table 1과 같이 대조군(A군)에서는 탄수화물 73%, 지질 8%, 실험군(B군)에서는 탄수화물 55%, 지질 25%로 설정하고 그 외의 성분들은 모두 동일하게 설정하였다. 실험 초기 제조한 식이가 실험 말기에 고갈되는 상황이 일어나 추가로 식이를 제조하였고, 아래의 표에는 그 첨가량도 함께 더하여 제시하였다. 식이섭취량은 3~5일 간격으로 측정하였는데, 식이 제공 전 남은 식이량을 측정하여 섭취량을 측정한 후 250g을 맞추어 제공하였다. 체중은 7일 간격으로 관측하였다. 변 무게는 총 2번 측정하였는데, killing 전에 각각의 쥐들로부터 변을 수집하여 무게를 측정하였고, 오븐에 넣은 후 변 무게를 재측정 하였다. 실험이 종료된 이후, 작두로 흰 쥐를 희생시켜 혈액을 채취하고, 해부를 통하여 흉선, 비장, 소장, 지방, 콩팥, 간을 채취하였다.
Table 1. 본 실험에서 흰 쥐에게 제공한 식이조성
대조군(A군) 실험군(B군)
Carbohydrate starch 73% 29%(1276g) 55% 22%(924g)
sugar 44%(1936g) 33%(1386g)
Protein casein 15%(664g) 15%(634g)
Fat corn oil 8% 8%(352g) 25% 8%(336g)
shortening - 17%(714g)
butter - -
Minerals 3.5%(154g) 3.5%(147g)
Vitamin 1.0%(44g) 1.0%(42g)
Choline chloride 0.2%(8.8g) 0.2%(8.4g)
합계 4400g 4200g
혈청 내 지질함량 측정 : FRINGS 법
Reagent에는 Conc. H2SO4, O.6% vanillin solution, Phosphoric acid, 0.6% vanillin solution 200ml를 1L Elrenmyer Flask에 넣고 Conc. Phosphoric acid 800ml를 넣고 갈색병에 저장한 Phospho-vanillin reagent, 1g olive oil/ 100mlabsolute ethanol(1mg/0.1ml)로 만든 Stock solution, Working standard 그리고 Stock solution로부터 1,2,3,6ml을 각각 15ml tube에 넣고 거기에 10ml이 되도록 absolute ethanol을 넣어 (9,8,7,4ml)만든 working solution이 있다. 먼저 각각의 working standard 0.1ml와 sample 혈청 0.1ml에 conc. H2SO4 2ml을 넣고 잘 섞었다. 그 후 Boiling water bath 에서 10분간 가열한 후 5분간 얼음에서 식혔다. 다음으로 0.1ml의 상등액 aliquot를 취하고 unknown sample을 만든 후 0.1ml Conc. H2SO4 를 취하여 Blank를 만들었다. 마지막으로 5ml phosphor-vanillin reagent를 각 시험관에 넣고 잘 섞은 후 15분간 37℃에서 incubate시키고 실온에서 5분간 식혔다. 이것을 Spectrophotometer 540nm에서 흡광도를 측정하여 O.D를 계산하였다.
간 내 지질의 분리 : FOLCH 법
조직 속의 lipid를 유기 용매인 chloroform과 methanol mixture로 추출해 내는 실험으로, Reagent로는 CHCl3 : MeOH = 2:1 로 섞은 용액, Upper phase solution CHCl3 : MeOH : water = 3:48:47 그리고 NaSO4 , anhydrous를 사용하였다.
실험 방법은 먼저 0.5g의 생 liver를 6ml의 CHCl3 : MeOH solution에 넣고 homogenizer에 넣어서 homogenize하였다. 그 후 여과지를 큰 petri dish에 넣고 CHCl3나 CHCl3 : MeOH solution으로 침지시켜 여과지 안에 불순물, lipid를 제거하였다. Homogenize시킨 것을 30ml mass cylinder에 깔대기를 놓고 탈지된 여과지를 대고 여과한 후 3ml의 CHCl3 : MeOH solution으로 2-3번 washing해서 넣고, pipette으로 CHCl3 : MeOH solution을 빨아 깔대기 주위를 다시 washing하였다. 이렇게 해서 total 액이 처음 사용한 tissue의 20배가 되도록, 즉 10ml가 되도록 만들었다. 이것을 원심분리관에 넣고 10ml의 20%, 즉 2ml의 증류수로 cylinder 벽을 닦아 내어 원심분리관에 넣었다(물이 들어가면 맑은 액이 뿌옇게 된다). 이것을 초자봉으로 잘 mix 하였고, 이것을 2400 r.p.m에서 20분간 원심분리하였더니 2부분으로 나누어진 것을 볼 수 있었다. 상액층을 긴 spoid로 밑층이 닿지 않도록 최대한 제거하였다(상층: lipid외의 불순물→제거, 하층: lipid부분). Upprer phase solution 1.5ml를 pipette으로 뽑아 원심분리관의 벽에 pipette를 끝에 대고 관을 돌리면서 넣고, 위의 액을 spoid로 제거하였다. 이 절차를 두 번 반복 하였다. 그 후 탈수제 3g정도를 넣고 초자봉으로 섞었다. 그리고 감압 농축기의 flask를 무게를 재고, 여기에 깔대기를 대고 탈지된 여과지를 대고 위의 액을 넣어 여과시켰다. CHCl3 : MeOH solution을 2.5ml정도 넣고 washing해서 깔대기에 부어, 이것을 2-3번 반복하였다. 이것을 감압 농축기로 약 15분간 감압 농축하였더니 flask 벽에 갈색 lipid가 남고, 유기물은 증발하였다. Flask를 aluminum foil로 뚜껑을 하여 dessicator안에서 보관하여 식힌 후 lipid의 무게를 재었다. 그리고 이것을 일정량의 CHCl3 로 녹여 TLC로 lipid fraction하였다.
혈청과 간의 콜레스테롤 측정
Reagent에는 cholesterol, glacial acetic acid, FeCl36H2O , Conc. H2SO4, chloroform이 있다. 우선 첫 번째로 calibration standard를 제조하고 난 후, calibrating standard를 0.5, 1, 1.5, 2ml로 각 시험관에 넣고 ferric chloride diluting agent 4 (blank), 3.5, 3, 2.5, 2ml를 넣어 총 4ml씩이 되게 하였다. Working standard 4ml에서 3ml를 취해 Conc. H2SO4 2ml를 넣고 실온에서 20분 이상 식힌 후 흡광도를 재었다.
혈청의 cholesterol 분석은 다음의 과정으로 이루어졌다. serum 0.1ml 안에 ferric chloride precipitating agent 4ml씩을 넣었다. 2-3분 후 이 mixture를 10분 동안 원심분리 하였다. 25*100mm test tube 안에 여과액 3ml를 넣었다. Blank는 ferric chloride diluting agent를 이용한다. 그런 후, Conc. H2SO4 2ml를 조심스럽게 넣은 후 vortex mixer로 완전히 mix하여 실온에서 이 용액을 20분 이상 식힌 후, spectrophotometer 560nm에서 흡광도를 재었다.
간은 2ml의 chloroform을 넣어서 간 지방을 녹였다. 이
김화영, 강명희, 『영양상태 판정』, (신광출판사 : 2008)
홍소영, 『가르시니아 캄보지아 추출물(HCA)이 고탄수화물 및 고지방 식이를 섭취한 흰쥐의 체중과 지질 대사에 미치는 영향』, (이화여대 대학원 : 2007
