분야
docx1 Restriction enzyme 처리
2 Gel electrophoresis (FabG DNA insert 와 pET-14b vector 확인)
3 Gel purification (insert gene)
4 Ligation (pET-14b + FabG)
▶관찰 및 결과
1 Restriction enzyme 처리
2 Gel electrophoresis (FabG DNA insert 와 pET-14b vector 확인)
3 Gel purification (insert gene)
4 Ligation (pET-14b + FabG)
▶관찰과 결과
▶Discussion
◆실험 첫째날 2011년 10월 24일 월요일
▶원리
1 Restriction enzyme 처리
- 이 실험에서 우리는 아무 처리되지 않은 plasmid와 foreign gene을 plasmid에 삽입하여 만든 inserted plasmid에 각각 제한효소를 처리하는 실험을 했다.
- 제한효소란 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 인식부위 또는 그 근처의 특정 이중사슬을 절단하는 대표적인 endonuclease로서 재조합 DNA를 만들기 위해 사용된다. 이중사슬의 절단은 nucleotide간의 phosphodiester 결합을 끊어내는 것을 의미한다. 제한효소는 그 특성에 따라 type Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ로 나뉜다. typeⅠ과Ⅲ는 특정한DNA서열을 인식하지만 인식부위가 아닌 곳을 절단하는 제한효소이며 typeⅡ는 인식부위와 절단부위가 일치하는 효소이다. 그러므로 대부분의 실험에 쓰이는 제한효소는 typeⅡ이다. 절단 후 DNA말단의 모양은 각 효소에 따라 sticky end와 blunt end가 만들어 질 수 있다.
시약설명 및 주의할 점
- 우리가 한 실험에 쓰이는 제한효소는 인식부위(CATATG)를 가지는 Nde I와 인식부위(GGATCC)를 가지는BamH I으로 typeⅡ이며 BamH I의 경우 sticky end를 만든다.
- DDW(double distilled water)는 일반적으로 물에 들어있는 이온들의 농도가 극히 적은 증류수를 말하며 순수한 물이라고 봐도 무방하다.
- reaction buffer는 MgCl2를 포함하며 제한효소에게 금속이온으로써 보조인자 역할을 한다.
- 효소 및 DNA의 냉동보관 이유 : 효소는 -20℃, 50% glycerol이 들어있는 완충액 내에서 안정하게 존재한다. DNA를 상온에서 보관할 경우 DNA간 충돌에 의해 파괴될 수 있기 때문에 냉동보관 해야 한다.
- centrifuge의 원리 : centrifuge란 회전에 의한 원심력을 이용하여 성분이나 비중이 다른 물질을 분리시키는 장치를 말한다. 원심력의 크기, 입자의 크기와 밀도에 따라 침전되는 물질이 달라진다.
