분야
hwp- 개발 목적
2. 본 론
- DNA 분리 및 정제
- Genomic DNA library
- Screening
- restriction mapping
- subcloning
- transformation
- 유전자 발현 방법
- 재조합 E. coli 와
재조합 Saccharomyces cerevisiae 비교
3. 결 론
개발목적
화석연료의 과도한 소비에 따른 지구온난화 및 계속되고 있는 고유가에 따라 세계 각국은 석유를 대체 할 수 있는 새로운 에너지 개발에 앞장서고 있다. 그러한 대체에너지 개발의 일환으로 식물성 바이오매스(biomass) 자원으로부터 에탄올을 생산하기 위한 기술이 다시 주목받고 있다. 이러한 식물성 바이오매스는 태양이 존재하는 한 지구상에서 무한정 생산이 가능한 지속가능한 자원으로서 그 핵심에는 리그노셀룰로스.(lignocellulose)가 있으며 이는 포도당으로 전환이 가능한 셀룰로스(cellulose)를 포함하고 있기 때문이다. 셀룰로스는 지구상에서 가장 풍부한 자원으로서 포도당으로 가수분해 될 경우 많은 미생물에 의해 발효 및 생물 공학적 전환이 가능한 기질이기 때문에 대체에너지원으로서 주목받고 있다.
그래서 우리는 바이오매스를 경제적으로 활용하기 위해서 바이오매스의 주성분인 cellulose와 lignocellulose를 가수 분해 시키는 새로운 효소를 찾아 알콜 발효 균주인 효모(yeast)에 형질 전환시켜 새로운 균주를 개발하게되었다.
2. 본 론
효소의 선정
우리조는 cellulose와 lignocellulose를 가수 분해 시키는 새로운 효소를 생산하는 균으로 Trichoderma와 백색부후균을 선정했다.
균종류
특징
생산효소
Trichoderma
불완전 균의 한 속. 토양, 낙엽, 그루터기, 썩은 나무 따위에 나는 곰팡이로 생태계 속에서는 유기물의 분해에 중요한 역할을 한다. 세균이나 곰팡이에 대한 항생 물질을 생산하기 때문에 식물의 병원균 퇴치에 사용
cellulose분해효소
(셀룰라아제)
백색부후균
(white-rot fungi)
목제부후균의 대부분을 차지한다. 부후재의 외관이 색이 바란다든지 하얗게 변화되기 때문에 백색부후균이라 칭한다. 갈색부후균과는 대조적으로 자연계에서는 활엽수재에서 많이 발생한다
헤미셀룰로, 리그닌
분해효소
각각의 특징은 다음과 같다
1) DNA 분리 및 정제
(1) Total cell DNA의 분리
: 다음 4 단계 과정을 거쳐 배양물로부터 total DNA를 분리하였다.
① 세포배양액 - 증식, 수확(원심분리 이용)
② 세포파괴(cell lysis) - 내용물 방출
③ DNA만 분리 - 단백질 제거(페놀 처리), RNA제거(Rnase 처리)
④ DNA 농축 - 2 vol.의 에탄올(EtOH) 처리
⑵ 세포 추출물의 분리
: DNA 추출하는 모든 과정은 세포질 함유물을 용액으로부터 유리시켜야 한다. 동물이나 식물의 시료는 과정에 들어가기 전에 아주 작은 절편으로 갈아야 한다. 견고한 세포벽을 가지고 있기 때문에 믹서기와 같은 기계로 세포를 파괴하거나, 세포벽 구성성분을 소화할 수 있는 특정 소화효소를 첨가한다. 이어지는 SDS(Sodium Dodecyl Sulphate) 처리는 세포막의 지질 분자를 제거한다.
⑶ 세포 추출물로부터 DNA의 정제
: 원심분리에 의해서 세포 찌꺼기를 제거한 후에도 용액에는 DNA뿐 아니라 다량의 단백질과 RNA가 포함되어 있기 때문에 다음과 같은 방법으로 단백질과 RNA를 제거했다.
① 단백질 제거방법 - 페놀 추출법
: 단백질을 제거하는데 효율적인 페놀 추출법을 이용하였다. 페놀은 유기용매로써 단백질을 변성, 침전시킨다. 한 번의 페놀 처리로 단백질이 완전히 제거되지 않는 경우, 여러 번 반복 수행한다. 그러나 반복될수록 DNA가 절단될 가능성이 높아지기 때문에 상황에 따라서단백질 분해효소(protease)를 처리하기도 하였다.
( 페놀 또는 페놀 : 클로로포름(phenol:chloroform) (1:1)을 첨가한다. )
