분야
doc1. Date
2. Subject & Purpose
3. Principle
1) Restriction enzyme
2) Electrophoresis
4. Materials & Equipments
5. Procedure
1) Digestion of DNA with Restriction Enzyme
2) Agarose Gel Electrophoresis
3) Gel Purification
6. Observations & Results
7. Discussion
1. Date
2. Subject & Purpose
3. Principle
1) Cloning vector(plasmid & pET-14b)
2) Ligation
3) Competent Cell 을 이용한 Transformation
4) Ligation 과정에서 Plasmid 와 insert DNA 의 비율 맞추는 계산.
4. Materials & Equipments
5. Procedure
1) Ligation Reaction
2) Preparing Competent Bacteria
3) Heat Shock Transformation
6. Observations & Results
7. Discussion
1. Date
2. Subject & Purpose
3. Principle
4. Materials & Equipments
5. Procedure
6. Observations & Results
7. Discussion
1. Date
2. Subject & Purpose
3. Principle
4. Materials & Equipments
5. Procedure
6. Observations & Results
7. Discussion
1. Date
2. Subject & Purpose
3. Principle
4. Materials & Equipments
5. Procedure
6. Observations & Results
7. Discussion
8. 실험을 통해 느낀 점
Day 1 – 2008년 10월 27일 월요일
2. Subject & Purpose
Digestion of DNA with Restriction Enzyme & Agarose Gel Electrophoresis & Gel Purification
Plasmid pET vector와 FabG gene이 insert된 pET vector를 두 가지 제한효소, BamHⅠ과 NdeⅠ으로 자른 다음 전기영동을 통해 결과를 확인하고 Purification을 한다.
3. Principle
1) Restriction enzyme
DNA 는 특정부위를 자르고 붙일 수 있다. DNA를 자른다는 것은 nucleotide 들이 연결되어 있는 phosphodiester 결합을 끊어내는 것을 의미한다. 이러한 역할을 하는 효소를 nuclease 라고 하며 바깥쪽을 자르는가 안쪽을 자르는가에 따라서 각각 exo/endonuclease 라고 부른다. Endonuclease 의 대표적인 것이 바로 제한 효소 (restriction enzyme, restriction endonuclease)이며, DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다. 제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오는 바이러스와 같은 외부 DNA 를 제거하기 위한 방어기전으로 가지고 있는 것이며, 자신의 DNA 는 절단부위의 염기 (adenine, cytosine)를 methylation 시켜서 자신의 제한효소가 자신의 DNA 를 자를 수 없게 보호하고 있다. 제한효소는 3가지로 나눌 수 있으며 실험실에서 사용되는 것은 대부분 Type Ⅱ 이다.
# Type Ⅱ restriction enzyme : 인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생물학 연구에 아주 유용하게 이용되고 있다. 실험에 쓰이는 제한효소는 특별한 말이 없는 한 typeⅡ를 말한다. 대부분의 typeⅡ제한효소는 4개, 5개, 또는 6개의 염기서열을 인식하는데, 이에 따라 DNA상에 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다 즉 6개의 염기서열을 인식한다면 이론상 46=4096 base pair마다 한번씩 출현하게 된다. 제한효소의 명명은 발견된 세균의 이름 및 serotype에 따라서 붙이게 된다. 즉 Hinf Ⅱ는 Haemophilus influenza type f에서 분리된 것이다. 제한효소가 인식할 수 있는 부위는 palindrome, 즉 앞으로 읽으나 뒤로 읽으나 뒤로 읽으나 염기서열이 같은 모양을 하고 있는 것이 특징이다. 잘린 후의 DNA오양은 5’-overhang cohesive end, 3’-overhang cohesive end(sticky end)또는 blunt end가 만들어질 수 있으므로 목적에 따라서 잘 선택해서 사용해야 한다.
2) Electrophoresis
Electrophoresis 기기에는 - charge에서 + charge로 전기가 흐르고 있다. 그리고 그물 망 구조를 가지고 있는 agarose gel이 있다. 그래서 well에 DNA를 loading하게 되면 크기와 무게, 모양에 따라서 많이 이동할 수도, 적게 이동할 수 있다. 이 차이를 가지고 어느 band가 어떤 물질을 가지고 있는지를 확인할 수 있다.
① Agarose gel 전기영동 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들
a. DNA분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
b. Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
c. DNA형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그 다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.
d. 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
e. 전기장의 방향도 이동 속도에 영향을 미친다.
f. Ethidium bromide는 DNA이동속도를 15%정도 감소시킨다.
g. 전기영동 buffer의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.
② DNA loading buffer
Agarose gel의 well에 DNA를 넣어 줄 때, DNA용액을 무겁게 하여 agarose의 홈으로 가라 앉히는 역할을 하며, 그 성분에는 전기영동시 이동속도가 다른 두 개의 염색시약이 들어 있어, DNA와 같이 전기영동 될 때, DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
③ 전기영동 buffer
TAE (Tris-acetate EDTA):DNA분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis 에서 쓴다.
TBE (Tris-borate EDTA):DNA분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
4. Materials & Equipments
Restriction enzymes(BamHⅠ, NdeⅠ), pET-14b plasmid, FabG gene이 insert된 pET-14b plasmid, DDW, 10ⅹreaction buffer, 1ⅹTAE buffer, agarose, ethidium bromide, DNA ladder, DNA loading buffer,
pipette, binding column, spindown centrifuge, Water bath, microwave, Electrophoresis tank, e-tubes, ice box, gel cast, blade, heat block, vortex, table top centrifuge
5. Procedure
1) Digestion of DNA with Restriction Enzyme
① Extracted plasmid와 buffer, DDW를 먼저 섞고 마지막에 제한효소를 넣는다.
Plasmid only or inserted Plasmid 5 μl
