![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-1](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0001.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-2](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0002.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-3](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0003.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-4](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0004.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-5](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0005.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-6](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0006.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-7](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0007.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-8](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0008.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-9](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0009.gif)
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![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-19](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0019.gif)
![[분자생물실험] DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자 분리-20](http://images.happyhaksul.com/thumb/368/367599-0020.gif)
분야
docPurpose
Principal
1)Restriction enzyme
2)DNA electrophoresis(agarose gel)
(1)기본원리
(2)Agarose gel에서 DNA migration rate에 영향을 주는 factors
(3)전기영동 완충액(Buffer)
(4)DNA loading buffer.
(5)DNA의 가시화
Material
1.Digestion of DNA with Restriction Enzyme
2.Agarose Gel Electrophoresis
3.Gel purification
Procedure
1.Digestion of DNA with Restriction Enzyme
2.Agarose Gel Electrophoresis
3.Gel purification
Result
Subject 1:얻은 FabG gene을 pET-14b에 삽입
Purpose
Principal
Material
Procedure
Result
Subject 2:FabG gene이 삽입된 DNA를 CP cell에 주입
Purpose
Principal
1)Competent cell (CP cell)의 제작
2)Transformation
Material & Equipments
Procedure
1.Preparing competent bacteria
2.Heat shock transformation
Result
Discussion
Subject:Selection of Transformants
Purpose
Principal
Material & Equipments
Procedure
Result
Subject:Plasmid mini-prep
Purpose
Principal
Material
Procedure
1.Plasmid Mini-Prep
2.Electrophoresis
Result
Discussion
1.중화 단계에서의 실수로 인해 DNA 복원이 제대로 이루어지지 못했다?
2.항생제 앰피실린에 문제가 있었다?
Subject: Polymerase chain reaction
Purpose
Principal
1.RCR
2.Agarose Gel electrophoresis
Material
1.Template DNA
2.Primer
3.dNTP(deoxynucleotide triphosphate)
4.10x PCR 완충용액
5.Taq DNA polymerase
Procedure
Result
Discussion
Purpose: DNA sub-cloning에 사용할 원하는 유전자를 만들기 위해 plasmid(vector)내에 restriction enzyme을 사용하여 DNA를 자르고 원하는 유전자를 삽입한 후, 목적하는 유전자가 정확하게 cloning되었는지 DNA 전기영동 결과를 분석하여 확인할 수 있다. 그리고 Agarose gel로부터 DNA band를 추출하여 DNA를 추출한다.
Principal:
1) Restriction enzyme
제한효소란, DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 2중 사슬을 절단하는 endonuclease(핵산분해효소의 하나)를 뜻한다. 제한효소는 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소로 알려져 있는데, 여기서 말하는 ‘제한’이란, 이질(異質)의 숙주(宿主) 중에서 증식한 DNA의 침입을 받았을 때 그 DNA와 자기의 DNA를 식별하고 분해해 버리는 현상을 말하며, 그런 작용을 하는 효소를 제한효소라고 한다. 제한효소는 그 특성(절단양식이나 활성발현인자 등)에 의해 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ형의 3종류로 구별할 수 있다.
제한효소의 DNA 절단보통 사용하는 제한효소(Type Ⅱ)는 6개의 특수한 염기서열을 인식한다. 예를 들어 EcoR I 이라는 제한효소의 경우 GAATTC라는 염기서열을 인식하고 G와 A부분을 자른다. 즉 DNA 이중나선을 자르게 되면 아래의 그림과 같이 된다.
이런 식으로 잘리게 된다. 이러한 형태를 sticky end라고 한다. 중앙부를 잘라서 일자형으로 자르는 효소도 있는데 그것은 blent end라고 부른다. 생물체는 자신의 DNA를 보호하고 외부 DNA가 침입해왔을 때의 방어를 위해 제한효소를 사용한다. 외부 DNA를 제한효소로 잘라서 활성을 없애는 동시에 자신의 DNA는 보호하기 위해 자신(생물체)의 DNA는 제한효소가 절단부위를 감지하지 못하게 하기 위해서 특정 염기서열이 메틸화 한다(Methylation).
Restriction enzyme은 다양한 cut sites를 가진다. 이번 우리가 실험할 때 쓰게 될 restriction enzyme은 BamHⅠ 부위와 NdeⅠ 부위를 자른다. (왼쪽 그림은 Restriction enzyme cut sites )
2) DNA electrophoresis(agarose gel)
(1) 기본원리
DNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 기본원리를 갖는다. 이때 DNA분자가 gel matrix사이를 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 늦어지며 gel matrix가 치밀할수록(gel %가 높을수록)늦어지며, 또한 DNA분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 supercoiled DNA는 circular DNA보다 빠르게 움직이게 된다. gel의 재료는 agarose 나 polyacrylamide가 흔히 쓰이며 분리하고자 하는 DNA의 크기에 따라서 선택을 한다. agarose gel을 100bp이상 20kb까지의 DNA를 분리하는데 사용되며 polyacrylamide gel은 1kb이하 크기의 DNA를 분리하는데 이용된다.
(2) Agarose gel에서 DNA migration rate에 영향을 주는 factors
DNA molecule size, Agarose concentration, DNA의 conformation(superhelical DNA > circular DNA > nicked circular DNA), Applied voltage, Intercalating dyes, Electrophoresis buffer의 composition과 ion strength.
(3) 전기영동 완충액(Buffer)
TAE(Tris-acetate EDTA): DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophoresis에서 쓴다.
TBE(Tris-borate EDTA): DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
