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[생물학] 분자생물학 실습

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레포트 > 자연계열
2010.07.09
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분자생물학 용어와 개념

소개글

[생물학] 분자생물학 실습에 대한 자료입니다.

Experiment 1 : DNA sub-cloning

Ι. DNA sub-cloning 의 1단계 : 원하는 유전자를 분리한다

Principle

1. Genomic DNA의 분리
2. 제한효소(restriction enzyme)에 의한 유전자의 분리
3. 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의한 유전자의 분리

Ⅱ. DNA sub-cloning 의 2단계 : 얻은 유전자를 cloning vector에 삽입한다.

Principle

1. Cloning vector (pET-14b)
2. Ligation (pET-14b + FabG)

Ⅲ. DNA sub-cloning 3단계 : 유전자가 삽입된 DNA를 세포 안으로 주입한다.

Principle

1. Competent cell 의 제작
2. Transformation (electroporation)
3. Genetic marker (X-gal & ampicilin)을 이용한 trasnformant 선발

Ⅳ. DNA sub-cloning 4단계 : Plasmid preparation(플라스미드 DNA의 정제)

1. 단백질 제거 방법(표준 방법)
2. 플라스미드 DNA의 정제

Experiment 2 : PCR에 의한 유전자 발현 확인

Ⅰ. PCR에 의한 유전자 발현 확인의 1단계 : RNA extraction(RNA 추출)

Ⅱ. PCR에 의한 유전자 발현 확인의 2단계 : Polymerase Chain Reaction(PCR)
Ⅲ. PCR에 의한 유전자 발현 확인의 3단계 : RT(Reverse Transcriptase)-PCR

Ⅳ. PCR에 의한 유전자 발현 확인의 4단계 : 정량을 위한 PCR methods

Conclusion

Discussion

본문내용

1. 정확한 위치에서의 DNA 절단: 염기서열에 특이적인 restriction endonucleases는 클로닝에 필수적인 분자 가위 역할을 한다
2. 자기 자신을 복제할 수 있는 작은 DNA 분자를 선택: 이러한 DNA를 cloning vector라고 한다. Vector는 운반체이며 전형적으로 플라스미드 또는 바이러스의 DNA가 있다.
3. 두 DNA 조각을 공유결합으로 연결: DNA ligase가 이 역할을 담당한다. 두 가지 이상의 재료에서 유래된 DNA조각들이 공유결합으로 연결되어 구성된 DNA 분자를 recombinant DNA(재조합DNA)라고 한다.
4. 재조합 DNA를 시험관으로 이동: DNA 복제를 위한 효소 장치를 제공하는 숙주세포로 이동시킨다.
5. 재조합 DNA가 들어 있는 숙주세포를 선택 또는 확인: 항생제 내성을 이용해서 원하는 유전자를 선별한다.

Ι. DNA sub-cloning 의 1단계 : 원하는 유전자를 분리한다

Principle

1. Genomic DNA의 분리

Bacterial cell의 배양물로부터 total DNA를 준비하는 방법은 4단계로 나눌 수 있다. 가장 먼저 bacterial cell 배양물의 증식 및 수확을 한다. 이 방법은 bacteria를 배양한 뒤 centrifugation을 통해 cell의 pallet을 분리한다. 다음으로는 세포 추출물을 분리하는 단계인데 cell의 구성성분 중 필요 없는 부분을 부수어서 open시킨다. 그리고 세포 추출물로부터 DNA를 정제해야 하는데 이는 DNA를 제외한 RNA나 protein을 제거하는 과정이다. 마지막으로 남은 DNA sample을 농축하는 과정을 거친다. 4단계의 과정을 좀 더 자세히 알아보면 다음과 같다.

a. Bacterial cell 배양물의 증식 및 수확

37℃, LB 배지, 200 rpm shaking incubator에서 E. coli의 doubling time은 20분이고, maximum density인 약 2~3 X 109 cells/ml 에 도달할 때까지 분열한다. 배양물의 증식 정도는 OD값 측정(600nm)으로 알 수 있다. 적당히 증식된 세포를 centrifuge tube로 옮기고 원심분리 시킨 후, 상층액을 버리고 pellet을 작은 부피로 resuspend시킨다. (배양액 1000ml을 원심 분리시킨 경우 pellet에 10ml 또는 그 이하의 배지를 붓고 resuspend시킴)
Cf. 대부분의 bacteria는 broth culture인 liquid medium에서 잘 생장한다. Liquid medium은 그 구성성분을 알 수 있는 defined medium(ex. M9)과 구성 성분을 알 수 없는 undefined medium(ex. LB)이 있는데 이번 실험에서는 LB배지를 사용하였다.

참고문헌

 http://blog.naver.com/genetic2002/30034626247
 http://cafe.naver.com/takarapcr.cafe?iframe_url=/ArticleRead.nhn%3Farticleid=8
 http://blog.naver.com/ekdrmsdlfkd?Redirect=Log&logNo=20008133898
 http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction
 http://blog.naver.com/lmsgood01?Redirect=Log&logNo=20043971434
 http://www.invitrogen.com/site/u...PCR.html
 http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/RNA_analysis.php
 http://catalog.takara-bio.co.jp/...%3DC0193
 Gene Cloning & DNA Analysis 5/E 408에서 3장 참조

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