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[분자생물학] DNA sub-cloning, Polymerase Chain Reaction(PCR)

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소개글

[분자생물학] DNA sub-cloning, Polymerase Chain Reaction(PCR)에 대한 자료입니다.

Sub cloning단계
1. 원하는 유전자 분리 (2010. 11. 15)
- Restriction enzyme 처리
- Gel electrophoresis
- Gel purification
2. Cloning할 유전자를 cloning vector(plasmid)에 삽입(2010. 11. 16)
- Ligation
- Competent cell 만들기
- Heat-shock을 이용한 transformation
- LB agar plate에 spreading
3. 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입(2010. 11. 17)
- Transformation 확인
- LB broth에 transformant를 multiplication
4. 올바른 clone의 증폭(2010. 11. 18)
- Plasmid mini-prep

본문내용

◈ Observation & Result
Ligased plasmid + 만든 CP Cell
Ligation + 상용 CP cell
Inserted plasmid + 상용 CP Cell
Plasmid only + 상용 CP cell

실험5 Subject Transformant 확인/ LB Broth에 (containing 100μg/ml of ampicillin) transformant를 multiplication

◈ Purpose
전날 만든 transformant가 제대로 배양되었는지 colony를 확인하고, ampicillin을 처리해서 원하는 gene이 제대로 inserted된 것인지 아니면 self-ligated plasmid인지 확인한다.

◈ Principle
형질전환된 세포의 선별
예를 들어 1ng의 pUC8으로 1,000~10,000 형질전환체(transformant)가 생길 수 있지만 이것은 유용한 분자 전체의 0.01%에 불과하다. 게다가 10,000형질전환체는 수용세포 배양물에 존재하는 전체 세포 수의 매우 작은 비율이다. 따라서 플라스미드를 uptake한 세포를 구별해야 할 필요가 있다. 이를 위해 선별 마커(selectable marker)를 이용한다. Selectable marker란 비형질전환체(non-transformant)가 가지고 있지 않은 새로운 특징을 형질전환된 세포에 제공하는 유전자를 말한다. 대부분의 플라스미드 클로닝 벡터는 숙주세포에 항생제 저항성을 제공하는 적어도 하나의 유전자를 가지고 있다.
그러나 항생제에 대한 저항성은 단순히 플라스미드가 형질전환된 세포내에 존재하는 것에 달려있는 것이 아니라, 플라스미드의 저항성 유전자가 발현되어 항생제를 무독화시키는 효소가 합성되어야 한다. 저항성 유전자의 발현은 형질전환 직후에 시작되지만 항생제의 독성효과를 견디어 낼 만큼 충분한 효소를 보유하기 위해선 시간이 필요할 것이다. 이러한 이유로 형질전환된 세균을 heat-shock 처리 직후에 선별배지(selective medium)에 플레이팅(plating)해서는 안되며 우선 항생제가 없는 배지에서 짧은 시간 동안 배양시켜야 한다. 그런 후에 형질전환된 세균이 플레이팅되어 항생제에 노출되었을 때 이들은 이미 생존할 수 있을 만큼 충분한 효소를 합성하고 있을 것이다.
Reference - http://blog.naver.com/tohmo/100010414612
◈ Reagent
LB broth, ampicilin

◈ Apparatus
yellow pipette, Round bottom tube 3개, 유성펜

◈ Procedure
1. 전날 LB agar plate에 spreading한
① ligation+우리가 만든 CP cell
② ligation+commercial CP cell
③ inserted plasmid+우리가 만든 CP cell/commercial CP cell
④ plasmid only+우리가 만든 CP cell/commercial CP cell의 transformant colony 확인
2. 3개의 Round bottom tube에 labeling한 후 LB Broth media(with 100μg/ml Ampicillin) 3ml씩 넣어준다.
3. Plate에 생긴 ‘ligation+우리가 만든 CP cell’의 colony를 3~5개 정도 유성펜으로 plate 표면에 동그랗게 표시한 다음 pipette에 tip을 끼워서 표시한 colony를 tip 끝으로 덜어낸다.
4. colony를 덜어낸 tip을 LB Broth media가 들어있는
round bottom tube에 떨어뜨린다.
5. inserted plasmid+commercial CP cell/plasmid
only+commercial CP cell의 colony도 똑 같은 방법으로
round bottom tube에 subculturing 한다.

◈ Observations & Results
① ligation+우리가 만든 CP cell
② ligation+commercial CP cell
③ inserted plasmid+우리가 만든 CP cell/commercial CP cell
④ plasmid only+우리가 만든 CP cell/commercial CP cell 중에서
2번 Agar plate에서 colony가 발견되지 않았다

#분자생물학 #DNA #subcloning #Polymerase #Reaction

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