분야
docx옥신은 식물 생장과 발달의 많은 측면을 조절한다. 옥신은 AUX/IAA protein의 분해를 통해 유전자 발현을 조절한다고 알려져 있다. AUX/IAA protein은 SCF^TIR1 으로 알려진 유비퀴틴 리가아제의 작용을 통해 분해되는 유전자 전사를 조절하는 repressor이고, 옥신은 AUX/IAA 단백질의 분해 속도를 빠르게 조정하는 역할을 한다. E3와 proteasome에 의해 AUX/IAA protein이 분해됨에 따라 IAA19를 포함한 auxin responsive genes가 발현될 수 있게 된다. 이번 실험에서는 NAA를 처리한 Arabidopsis와 NAA를 처리하지 않은 Arabidopsis의 tissue에서 각각 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하고, PCR을 진행하여 두 식물체에서 Auxin signaling gene인 IAA19의 발현량이 차이가 있는지 실험적으로 확인해보았다.
실험 방법
첫 주에는 RT-PCR에 사용할 cDNA를 만들기 위해 우선 NAA를 처리한 Arabidopsis와 NAA를 처리하지 않은 Arabidopsis의 RNA를 preparation하는 실험을 하였다. 우선 tube에 담긴 sample을 액체 질소로 얼린 후 즉시 갈아주는 작업을 7번 반복하였다. 이 때 세포 안의 RNase에 의해 RNA가 분해되지 않도록 sample이 녹지 않도록 시간을 지체하지 않도록 하였다. 그리고 sample이 들어있는 tube에 450ul의 RLT buf를 넣고 살짝 흔들어 주고 10분 정도 incubation을 하였다. 세포 내에 존재하는 cell debris를 제거하기 위해 보라색을 띤 Lilac spin column에 buffer를 옮긴 후에 13,000rpm에서 약 2분 동안 centrifugation을 해주었다. 그리고 상층액을 새로운 tube에 옮겼다. 200ul의 에탄올 용액을 넣은 후에 pink spin column에 용액을 옮겨주었다. 그 후에 700ul RW1 buffer용액을 넣고 15초 동안 10,000rpm으로 원심분리를 하였다. 그리고 500ul RPE buffer를 넣고 10,000rpm에서 15초간 spin-down해 주었다. 그 후 500ul RPE buffer를 넣고 2분 동안 10,000rpm에서 spin-down 해주었다. Collection tube를 빈 상태로 13,000rpm으로 1분간 spin down 해주었다. 그 후에 10,000rpm에서 1분간 30ul의 Rnase-free water를 넣고 spin-down 해주었다.
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Ibid., p.19
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Ibid., p.17
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Ibid., p.41
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
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http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
