분야
pptx무기화합물을 분리 정제하는데 사용
신부전증 환자의 혈청 크로마토그램
1
먼저 목차를 보시겠습니다
발표순서는
HPLC의 소개와 발달과정
그리고 기기구성과 기본원리 및 기기에 대한 설명
마지막으로 장. 단점과 사용분야에 대해서 발표하겠습니다
2
위에 그림은 HPLC에서 중요한 단어들입니다.
이동상은 칼럼을 통해 이동하는 용매이구, 정지상은 칼럼 안에 고정되어 머물고 있는 물질.
아래 그림에선
앞에 있는 용리액(Eluent)이 칼럼으로 들어가는 액체이고, 용출액(Eluate)은 칼럼을 지나 나오는 액체
3
크로마토그래피는 이동상에 따라 GC와 LC로 나뉘고, 또 각각 GC와 LC가 정지상을 기준으로 컬럼 크로마토그래피와 평면 크로마토피인 종이크로마토그래피 및 박층 크로마토그래피(TLC) 나뉘게 됩니다.
HPLC는 LC가 발전 개량된 형태입니다.
4
HPLC 란 :
고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC : High Performance Liquid Chromatography)란
LC의 일종으로서, 이동상인 액체를 사용하여 펌프로 이동상에 녹는 혼합물을 고분리 충진제가 충전되어 있는
컬럼속에 통과시켜 신속하게 분리, 용출시키고, 용출된 각 성분을 검출기의 기록계로 기록하는 방법이라고 할 수 있습니다.
초기 lc(액체크로마토그래피법)은 분리관 안에 150~200 μm 충진물입자를 사용하여 용리시간이 오래걸리는 단점을 보완하기 위해
고압펌프로 이동상을 가압하여 용리하는 방법을 사용한 크로마토그래피법이 hplc, 고성능 액체 크로마토그래피법이다.
Hplc는 이동상을 액체로 사용하고 정지상을 분리관형태로 사용한다.
지금까지 알려진 분리 방법 중에서 아마도 가장 신속하게 실시할 수 있는 것 중의 하나이다.
현재도 수많은 연구실에서 사용하고 있는 방법이며, HPLC 가 갖고있는 장점, 검출한계, 성분 및 장치의 선택 시 평가기준에 대한 관심이 점점 높아지고 있다.
5
초기의 LC는 모세관현상을 이용해 이동상인 용매와 시료를 흘려보내서 분석시간이 오래걸렸는데요~
분리를 신속하게 할 목적으로 고압 (High-pressure) 펌프를 개발함으로써 유속이 빨라지고 결과적으로 빠른 분석이 가능해졌습니다.
또 신속하게 시료를 분리하기 위한 고정상과 이동상 사이의 평형이 짧은 시간 0안에 이루어질 수 있는 고분리능 충진제가 개발되고
최근에 고성능 펌프, 각종 고 분리능 충진제, 고감도 검출기가 개발되어 오늘날의 HPLC(High-performance LC)가 완성 되었습니다.
따라서 HPLC는 초기에는 High-Pressure(고압)LC 으로 불렀으나, 오늘날에는 High-Performance(고성능)LC라 부르고 있습니다.
6
HPLC 기기의 구성은 크게 펌프, 시료 주입구, 컬럼, 검출기, 분획 수집기 및 컴퓨터로 되어있구요
시료 주입구에 시료를 넣어주면 이동상인 용매가 펌프압력에 의해서 용매와 함께 시료가 정지상이 있는 칼럼을 거치면서 혼합상태의 시료를 화학적/물리적 특성에 따른 머무름(retention) 정도의 차이에 의해 혼합성분을 각각의 단일성분으로 분리합니다.
분리된 시료는 검출기를 지나 분획수집기로 들어가고 컴퓨터에서 검출기에 입력된 전기신호를 분석해 크로마토그램을 보여줍니다.
일반적으로 시료는 컬럼 앞부분에 주입되어 이동상에 의하여 컬럼 안으로 들어가게 된다.
컬럼은 고정상과 이동상으로 구성되어 있고, 이 양자와 시료사이의 화학적, 물리적 상호작용으로 시료는 분리되어 컬럼 뒷부분에서 용출된다.
따라서 시료의 용출은 이동상의 유속과 컬럼 내부에서의 시료 각 성분의 상호 작용 크기에 따라 결정된다. 이동상이 기체라면 이 속도는 매우 빨라 고속분리가 비교적 용이하다. 그러나 이동상으로 액체를 사용하는 컬럼 크로마토그래피는 기체에 비하여 이동상의 점도가 매우 높기 때문에 컬럼을 통과하는 이동상의 저항이 증가하여 분리용출에 장시간이 걸린다.
7
HPLC 시스템의 펌프의 역할은 이동상으로 사용되는 용매를 저장용기로부터 시료주입기를 거쳐 컬럼으로 연속적으로 보내어 최종적으로는 검출기를 통과한 후 이동상인 용매와 시료 주입기를 통해 주입된 시료가 밖으로 나올 수 있도록 압력을 가해 주는 장치이다.
1. Pump의 요건
a. 일정한 유속과 압력 유지.
----> 펌프의 속도와 이동상 유량은 LC기기의 데이터 처리장치가 자동으로 조절
b. 가동이 쉽고 다양한 용매를 사용할 수 있어야 하고, 용매에 대한 내구성이 뛰어나야 하며, 용매와의 화학적 상호 반응이 없어야 한다.
---> 용매에 부식되지 않게 스테인레스 혹은 테플론 재질로 만들어야 하고 펌프에서 나오는 용매의 공급은 펄스가 없어야 한다.
Waters Pump는 이러한 Pump의 요건을 갖추고 있으며 특히 Gear방식을 채택하여 pulse의 발생을 최소화하였다.
2. Waters Pump의 특징
a. 정확한 유속과 유량 조절
b. Pulse 방지를 위한 system
(Gear 방식으로 Cam 방식보다 Pulse가 적다.)
c. 가동이 쉽고 여러 용매 사용 가능.
d. Isocratic에서 Gradient까지 사용.
e. 내구성이 우수.
GC와 좀 다르고 보다 중요
시료액을 움직이고 있는 이동상으로 운반해주는 주사장치이다.
시료는 소량으로 사용할 수록 좋고, 거름장치를 통해 거른 뒤에 주입한다
시료를 많이 넣으면 peak의 넓힘, 꼬리처럼 끌리는 현상이 나타난다
시료주입기가 갖추어야 할 요건은 다음과 같다.
사용하기가 편리해야 한다.
결과의 재현성이 있어야 한다.
- 시료가 컬럼에 좁은 띠 형태로 주입되어야 피크의 넓어지는 현상을 최소화할 수 있다.
시료주입기의 종류
시료주입기의 종류에는 밸브형 주입장치와 격막형 실린지 주입기, 자동 시료 주입장치 등이 있다.
9
1. Free injection 으로 실험실 생산성 향상
2. 96 Step의 조건입력 가능
3. 4 mL vial : 48개, 1 mL vial : 96개 사용함에 따른
무인 가동으로 분석시간 단축
4. 온도조절 가능 : 최대한 시료 변성 줄일 수 있음
5. 주입량에 따른 오차가 거의 없음 : 재현성 우수
6. Auto priming 및 Auto needle washing 이 가능함
이동상인 용매와 시료가 칼럼을 통과하면서 충진제와 열 즉, 화학적/물리적 특성에 따른 머무름(retention) 정도의 차이에 의해 혼합성분을 단일성분으로 분리합니다. 온도를 높이면 머무름 시간이 감소, 용질의 확산을 빠르게하여 분리도을 향상시킬 수 있다. 그러나 온도의 증가는 정지상의 성능을 약화시키고 칼럼의 수명을 단축시킨다. 만약에 칼럼의 온도가 제대로 조절되지 않으면 주변의 온도에 의해 쉽게 요동친다.
컬럼의 구성은
관 모양의 용기에 충진제를 채워서 사용하도록 구성되어 있으며, 분석시료의 종류에 따라 컬럼의 크기 및 충진제의 종류를 선택하여 사용한다.
충전 칼럼을 쓰는이유는?
액체의 확산속도는 일반적으로 기체의 확산속도보다 느리므로 열린관 칼럼을 사용하는 것은 적합하지 않다. 왜냐하면 짧은 시간 안에 용질 분자들이 횡단하기에는 용매 채널의 지름이 너무 크기 때문이다. 액체 크로마토 그래피는 충전 칼럼을 사용한다.
((참고))
열린관칼럼: 안벽에 정지상으로 덮여진 좁은 모세관으로 칼럼 중앙은 비워져 있다.
충전칼럼 : 정지상을 포함하고 있는 입자로 채워져 있다. 가격이 비싸고, 시료와 용매에 잔존하는 먼지나 입자와 같은 불순물과 비가역적으로 흡착 현상을 일으키게 되어 쉽게 성능이 떨어진다. 그러므로 주 칼럼의 입구를 길이가 짧고 주 칼럼과 같은 정지상으로 충전된 보호 칼럼(guard cloumm)으로 보호해야 한다.
11
@검출기. 검출기(Detector)
그닥 중요X
역할
- 검출기는 컬럼에서 분리된 시료를 검출하는 장치로 분석하고자 하는 시료의 종류에 따라 여러 종류의 선택이 가능하다.
Detector의 중요한 역할은 컬럼을 일정한 머무름 시간에 의하여 통과한 뒤 분리되어져 나오는 시료를 인지하여 각각의 원리에 의해 검출하여 이를 전기적 신호로 바꾸어주는 것 이다.
① Noise(바탕신호), Drift가 적어야 한다.
② Flow Rate, Temperature, Pressure에 안정해야 한다.
③ Sensitivity(감도)가 좋아야 한다.
자외선 검출기(UV detector)
가장 많이 사용되고 있는 검출기로써 화합물이 빛을 흡수하는 성질을 이용한 방법이다. 즉, 화합물들 중에는 자외선 혹은 가시광선 영역의 빛을 흡수하는 성질을 가진 화합물들이 있는데, 이들이 검출기의 셀을 지나면서 흡수한 빛의 양을 전기적인 신호로 바꾸어 주는 원리를 이용한 것이다.
UV-Vis 검출기는 약품, 식품, 향료, 펩타이드와 단백질 및 비타민 등의 다양한 분야에서 폭넓게 사용되고 있다.
- 사용이 간편하고, baseline 안정화 시간이 짧고 파장 선택 조절이 가능.
12
용매는
이동상이며, 이동상은 시료를 컬럼 속으로 통과 시킨다. 그러므로 용매는 시료를 용해시키는 것이어야 하며, 용매는 순도가 높아야 하고(불순물 섞이면 칼럼 부식시킬수도있다), 용매의 점도는 낮을 수록 좋다. 그리고 용질이나 충진제와 화학반응을 하지 않아야하고 정지상을 용해하지 않아야 한다
일반적으로 사용되는 용매의 예로는 핵산, 메탄올, THF, 물 등이 있다.
이동상의 극성에 따라 정상, 역상 액체 크로마토그래피로 구분하는데
정상LC는 친수성 정지상으로 소수성이 이동상으로 사용되어 시료의 성분중 친수성 정지상에 흡착되지 않는 극성이 가장 작은성분이 먼저 용리되어 나온다
역상LC는 정상LC와 반대이므로 극성이 가장 큰 성분이 처음에 용리되어져 나온다.
13
칼럼선택의 일반기준
HPLC의 장점
1.고압력 펌프에 의해 유속이 빨라져 분리가 분 단위 또는 초단위로 빠르게 이루어 질 수 있다
2. 시료의 혼합물이 각각의 성분으로 쉽게 분리되고, 정확하게 정량이 가능하다.
3. 분자량이 18에서 6백만까지도 HPLC로 분리할 수 있고, 시료형태가 액체 또는 고체도 가능하며, 이온상이나 결합물질에도 적용할 수 있다.
HPLC는
