DNA electrophoresis(agarose gel)
(1) 기본원리
DNAgel전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 기본원리를 갖는다. 이때 DNA분자가 gel matrix사이를
제한효소가 인식하는 부위는
5'--CCCGGG--3' 5'--CCC GGG--3'
3'--GGGCCC--5' 를 인식해서 3'--GGG CCC--5' 와 같이 수직으로 자르며 이를 blunt end 형태라고 부른다
3. 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의한 유전자의 분리
a. Agarose gel전기영동 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들로는 DNA의 분자
1. Date
Day 1 – 2008년 10월 27일 월요일
2. Subject & Purpose
Digestion of DNA with Restriction Enzyme & Agarose Gel Electrophoresis & Gel Purification
Plasmid pET vector와 FabG gene이 insert된 pET vector를 두 가지 제한효소, BamHⅠ과 NdeⅠ으로 자른 다음 전기영동을 통해 결과를 확인하고 Purification을 한다.
3. Principle
1) Restriction enzy
전기영동 tank에 1 X TAE를 넣은 후 gel을 넣는다. (이 때 TAE buffer는 gel이 살짝 잠길 정도로 붓는다.)
④ 2 µl의 100bp DNA ladder를 loading하여 DNA size marker로 사용한다.
⑤ 확인하고자 하는 plasmidDNA를 차례로 DNA loading buffer(1 µl)와 섞은 후, 각각의 well에 loading한다.
⑥ 75V 전압에서 전기영동을 하여, DNA가
coli의 doubling time은 20분이고, maximum density인 약 2~3 X 109 cells/ml 에 도달할 때까지 분열한다. 배양물의 증식 정도는 OD값 측정(600nm)으로 알 수 있다. 적당히 증식된 세포를 centrifuge tube로 옮기고 원심분리 시킨 후, 상층액을 버리고 pellet을 작은 부피로 resuspend시킨다. (배양액 1000ml을 원심 분리시킨 경우 pellet