DNA sub-cloning의 1단계: 원하는 유전자를 분리한다.
실험날짜 : 2011.10.24-28
실험목표 : DNA의 ligation/insertion process를 보고 그 결과를 확인한다. pET-14b vector에 antibiotic resistant 한 gene을 ligation 시키고, 후에 그 DNA를 component cell에 다시 삽입하여 ampicillin을 통해서 제대로 target gene이 삽입되었는지를 관찰하는 것
◆실험 첫째날 2011년 10월 24일 월요일
▶원리
1 Restriction enzyme 처리
- 이 실험에서 우리는 아무 처리되지 않은 plasmid와 foreign gene을 plasmid에 삽입하여 만든 inserted plasmid에 각각 제한효소를 처리하는 실험을 했다.
- 제한효소란 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 인식부위 또는 그 근처의 특정 이중사
20ml의 1 X TAE 용액에 agarose 0.4g을 섞어서 2%로 만든다. 열을 가하여 완전 용해 시키고 Ethidium bromide를 1mg/ml 농도로 첨가한다.
② 충분히 섞어 젤을 굳히는 판에 붓고 식을 때까지 기다린다. (굳힐 때는 comb를 끼워서 well을 만든다.)
③ 전기 영동 tank에 1 X TAE를 넣은 후 gel을 넣는다. (이 때 TAE buffer는 gel이 살
200 rpm shaking incubator에서 E. coli의 doubling time은 20분이고, maximum density인 약 2~3 X 109 cells/ml 에 도달할 때까지 분열한다. 배양물의 증식 정도는 OD값 측정(600nm)으로 알 수 있다. 적당히 증식된 세포를 centrifuge tube로 옮기고 원심분리 시킨 후, 상층액을 버리고 pellet을 작은 부피로 resuspend시킨다. (배양액 1000ml을
20 ℃에서 50% glycerol이 들어있는 완충액 내에서 안정하게 존재하므로 실온에 노출되는 시간을 가능한 줄여야 한다.
7. Pipetting을 한다. 가능한 기포가 생기지 않도록 주의 하면서 섞는다.
8. 약 3-5초 동안 짧게 centrifuge 하여 반응할 재료들이 바닥에 모이도록 한다.
9. 37℃(효소가 반응하기 가장 좋은 온
[분자생물학] DNA sub-cloning
분자생물학실습
