- 정제과정
플라스미드의 정제는 total cell DNA의 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라
가장 보편적으로 사용되는 방법
SDS와 NaOH를 이용해서 cell을 깨고 chromosomal DNA와 protein등을 denaturation 시킴
High pH : DNA가 base pairing을 못함
Plasmid의 경우 작고 CCC form 이기 때문에 완전히 나눠지지 못함
pH가 정상으로 돌아오면, chromosomal DNA는 Protein등와 함께 침전되고 Plasmid는 상층액에 속함
Phenol
Alkaline lysis method
- 세포의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA만을 분리하는 방법
- Chromosomal DNA 와 plasmid의 고유한 형태 구조 차이를 이용 !
; Chromosomal DNA - 상대적으로 size가 크고, double heilx
Plasmid - size가 작고, supercoiled 형태 -> pH에 변화에 의한 변성↓
Alkaline Lysis Method
DNA gel electrophoresis(전기영동)
- DN
Transformation한 후의 결과는 다음 세 가지 중의 하나로 생각할 수 있다.
㉠ Plasmid가 들어가지 않은 경우
㉡ Plasmid가 들어갔으나 plasmid에 원하는 gene이 들어가지 않은 경우
㉢ 원하는 gene이 포함된 plasmid가 들어간 경우
Plasmid에는 antibiotics resistance gene이 포함되어 있으므로 항생제가 포함된 배양
1. Date
Day 1 – 2008년 10월 27일 월요일
2. Subject & Purpose
Digestion of DNA with Restriction Enzyme & Agarose Gel Electrophoresis & Gel Purification
Plasmid pET vector와 FabG gene이 insert된 pET vector를 두 가지 제한효소, BamHⅠ과 NdeⅠ으로 자른 다음 전기영동을 통해 결과를 확인하고 Purification을 한다.
3. Principle
1) Restriction enzy