[졸업][농업생명] Programmed cell lysis system - pBlueLysis의 효용성 평가

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논문 > 공학계열
2005.03.23
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소개글

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Introduction

Material & method
1.Bacterial Strains and Plasmids
2.Media and Growth condition
3.Programmed self lysis system의 lysis를 측정하기 위한 Plsmid (pBlueLysis-gfp) 제작
4. GFPuv assay
5. DNA recombination methods

Results & Discussion
1. pBlueLysis에 의한 Cell Lysis 검증
2. pBlueLysis의 vector로서의 효용성 검증

Conclusion

Figure

Fig.1. pBlueLysis와 pGlys03의 genetic map …………………… 2
Fig. 2. Cloning of pBlueLysis-gfpuv for evaluation of cell
lysis by pBlueLysis …………………7
Fig. 3. Glucose 농도에 따른 Gfpuv의 세포 외 방출량 ……… 9
Fig. 4. Insert DNA size confirmed by PCR ……………… 13

Table

Table 1. 배지의 조성 ……………………………4
Table 2. Primers for gfpuv amplification………………4
Table 3. The sequences of M13F and M13R primers ……………12
Table 4. 각각의 경우 형성된 white colony의 수 ……………… 12

본문내용

Escherichia coli는 유전학적 연구가 가장 많이 되어 있는 세균으로서, 조작이 쉬운 장점이 있기 때문에 재조합 DNA을 만들고, 재조합 단백질을 생산하는데 많이 쓰이고 있다. 토양 등 환경의 DNA (metagenome)을 이용하여 유용한 물질을 얻는 목적의 metagenome library를 구축하는 경우에도 유용한 host로 쓰이지만 여기에는 치명적인 단점이 하나 있는데 바로 원하는 enzyme이나 bioactive product가 E.coli의 세포 내에서 만들어져 분비가 되지 않는다는 것이다. 이러한 점을 보완하기 위해 ultrasonication이나 D-cycloserine treatment가 흔히 사용된다. 그러나 이러한 방법은 복잡하고 시간이 많이 소요되며 경제적이지 못하다. 특히 대량으로 screening 할 경우, 이 단계를 생략하는 것이 많은 장점이 있다. 따라서 쉽고 경제적인 방법의 연구 개발이 필요한 실정이다. 올해 개발된 pBlueLysis vector system은 programmed cell-lysis system으로서 효과적인 screening 과정을 위해 개발되었다. 이 벡터는 X-gal을 이용한 blue/white 선별이 가능할 뿐 아니라, bacteriophage T4로부터 유래하여 박테리아의 세포막을 파괴하는 holin gene이 glucose의 농도에 따라 발현이 조절되는 ptsG 유전자의 promoter를 이용하여 발현되기 때문에 적절한 시기에 E.coli 를 lysis하게 만드는 기법이다.
여기에서는 programmed cell-lysis system으로 개발된 pBlueLysis system을 검증하고자 한다. 이를 위하여 이 vector에 클로닝 된 GFPuv가 cell 바깥으로 방출되는 정도를 측정하였고, vector로서의 효용성을 보기 위하여 insert DNA의 ligation 및 transformation 효율을 대조군과 비교하였다. GFPuv는 E.coli의 세포 내에만 축적되는 단백질이기 때문에, cell 바깥의 배지에 있는 GFPuv를 측정하면 cell lysis를 볼 수 있다.

참고문헌

강서원. 2004. Developing programmed cell-lysis system for screening metagenome library. 서울대학교 농생명공학부 석사학위 논문.
Gruendling, A., M. D. Manson, and R. Young. 2001. Holins kill without warning. PNAS 98: 9348-9352.
Morita, M., K. Asami, Y. Tanji, and H. Unno. 2001. Programmed Escherichia coli cell lysis by expression of cloned T4 phage lysis genes. Biotechnology Progress 17: 573-576.
Sambrook, J. and D.W. Russel. 2000. Molecular Cloning, a laboratory manual (3rd ed.), Cold spring harbor laboratory press.

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