I. Protein Extraction – Micro Smash MS-100 equipment 사용
<실험 전 준비>
얼음(정사각형 스티로폼), E-tube 총 38개(8개×4세트->extract 옮길 것(sonication), centrifuge 상층액 뜰 것, 정량할 것, western 용/ 6개-> standard곡선 그릴 것), screw tube(cap-tube, 뚜껑 초록색) 8개
1. E-tube에 bead (큰 것 2개, 작은 것 10개) 넣어서 ice-rack에
cationic 및 anionic detergent로 다시 나뉘며 이들은 highly denaturant로 monomeric protein으로 단백질을 분리시키는 특성이 있어 Westernblot analysis 및 분자량 측정 등에 주로 이용한다. 그리고 Triton X-100과 같은 non-ionic detergent는 less protein denaturant이기 때문에 protein-protein interaction등에 주로 이용된다. 또한 CHAPS 등과
단백질은 Bradford assay로 정량 할 수 없다.
- Bradford assay는 실온에서 사용가능하며, 어느 특별한 장비를 필요로 하지 않는다. (Spectrophotometer, cuvette, dye정도가 필요하다) 어느 단백질이든 동일한 dye를 더해준 후 약 5분 정도 반응시키고, 595nm에서 흡광도를 측정하기만 하면 되는 간단한 방법이지만, 대신 Coom
단백질은 coomassie dye에 안정적으로 결합하는데 이 결과로 reddish/brown form(465nm에서 최대 흡광)이 dyems blue form(610nm에서 최대 흡광)으로 스펙트럼 이동이 일어나게 된다. 두 가지 형태의 차이는 595nm에서 최대가 되는데, 따라서 이 파장이 coomassie dye-protein complex의 blue form을 측정하는데 최적의 파장이 된다
다. Amino Acid의 Titration과 pH buffer 작용
Amino Acid를 NaOH와 같은 염기로 Titration을 하여 얻어지는 Titration Curve는 적정하는 Amino Acid의 pH buffer 작용을 잘 설명해 준다.
즉 Amino Acid의 Carboxyl기는 Weak Acid이므로 NaOH-와 같은 Strong Base와 반응하면 일정한 pH 범위 내에서 큰 pH 변화를 일으키지 않는 pH Buffer 작용을 한