분자 전체의 0.01%에 불과하다. 게다가 10,000형질전환체는 수용세포 배양물에 존재하는 전체 세포 수의 매우 작은 비율이다. 따라서 플라스미드를 uptake한 세포를 구별해야 할 필요가 있다. 이를 위해 선별 마커(selectable marker)를 이용한다. Selectable marker란 비형질전환체(non-transformant)가 가지고 있지 않은 새
DNA를 절단, 제거하기 위한 방어기전으로 사용된다. 이 때, 자신의 DNA가 제한효소에 인식되어 잘리는 것을 막기 위해 자기 DNA 절단부위의 염기를 methylation 시켜서 보호하고 있다. 이러한 제한효소는 총 3종류로 나눌 수가 있지만 실험실에서는 대부분이 type Ⅱ 가 사용된다.
3. Type II restriction enzyme: 거의
제한효소에 의해 잘린 DNA들을 분리한다.
2. Principle
1) agarose gel electrophoresis 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들
a. DNA분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
b. Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
c. DNA 형태에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA > linear DNA > open circular DNA
d. 전압
실험실에서 종종 Selectable marker로서 이용된다. 이 같이 Plasmid에는 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자, 세균의 자웅을 결정하는 성 결정인자 등이 발견되고 있다. 또한 Plasmid는 다른 종의 세포 내에도 전달된다.
제한효소: DNA의 특정부위를 자르거나 붙일 수 있다. DNA를 자른다는 것은 DNA의 Nucleotide들
DNA분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.
TBE(Tris-borate EDTA) : DNA분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
Procedure
Material & Equipment
Restriction enzymes(BamHI, NdeI), pET-14b, FabG gene이 inserted pET-14b plasmid, DDW , 10 x reaction buffer, 1 x TAE buffer, agarose, DNA ladder, DNA loading buffer
Pipette, binding column, spindown centrifuge