1. DNA를 자른다는 것은 nucleotide를 연결하고 있는 phosphodiester bond를 끊어여러 DNA 단편을 만들어 내는 것을 의미한다. 이 때, 이런 역할을 하는 효소를nuclease라고 하며 그 종류로는 바깥 쪽을 절단하는 효소인 exonuclease와 안쪽을 절단하는 endonuclease가 있다.
2. 대표적 endonuclease인 제한효소(restriction enzyme)는
제한효소를 이용한 DNA 절단 및 분석, Ligation
3.1.1. Digestion of DNA with Restriction Enzyme
I. Apparatus
- Water bath, brief centrifuge
II. Reagents
- Plasmid, DDW, restriction enzymes [NdeI, BamHI], restriction enzyme reaction buffer
① NdeI: an endonuclease isolated from Neisseria denitrificans. In molecular biology, it is commonly used as a restriction enzyme.
② BamH
제한효소가 인식하는 부위는
5'--CCCGGG--3' 5'--CCC GGG--3'
3'--GGGCCC--5' 를 인식해서 3'--GGG CCC--5' 와 같이 수직으로 자르며 이를 blunt end 형태라고 부른다
3. 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의한 유전자의 분리
a. Agarose gel 전기영동 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들로는 DNA의 분자
nucleotide.
⑷ Taq polymerase : 유전자 합성효소. 효소이지만 열에 강하다.
5. PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점
⑴ Template DNA
선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA(cDNA), plasmidDNA 등을 쓸 수 있다.
1.실험 목적
- 분리한 plasmidDNA를 제한효소로 처리하고, 전기영동법과 PCR을 이용하여
DNA를 분리하고 확인하는 기술을 습득한다. 제한효소의 종류에 따른 절단 방식을
알아본다.
2. 실험 원리
1) 제한효소 (Restriction enzyme)
(1) 제한효소의 정의
* 제