![[공학] 단백질 분리 및 정제 실습-western blotting 을 이용한 protein separation과 purification-1](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547722-0001.gif)
![[공학] 단백질 분리 및 정제 실습-western blotting 을 이용한 protein separation과 purification-2](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547722-0002.gif)
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분야
docx▶ Subject
▶ Purpose
▶ Principle
▶ Materials
▶ Procedure
▶ Results
1. Acrylamide gel 만들기
위 Principle의 조성과 같은 비율로 만들어 준다. APS와 TEMED를 넣는 순간부터 gel이 굳기 때문에 꼭 마지막에 넣어 주어야 한다. Spacer plate와 short plate를 95% EtOH로 잘 닦아 준 후 겹쳐서 gel casting stand에 꽂은 다음 만든 gel을 투입하고 comb를 꽂아서 gel을 굳힌다.
2. Bradford assay
Standard를 잡기 위해 0, 1, 2.5, 5, 7.5, 10mg/ml의 농도로 준비된 BAS 2set를 5μl씩, DDW를 95μl씩 넣어주어 총 100μl가 되게 한다. 또한 insulin처리된 cell 3개, 그리고 control로 사용할 insulin처리되지 않은 cell 3개를 각각 2set씩 만든 후 이 sample 5μl와 DDW 95μl씩 섞어 100μl를 만들어 준다. 그리고 그 후 O.D값 측정 직전에 Bradford Working Solution을 900μl씩 넣어 주고 200μl씩 96well plate에 분주한 후 O.D값을 측정한다.
3. UV-Vis spectrophotometer이용한 O.D값 측정
4. Protein sample 처리
5X protein sample buffer로 처리한다. 이 buffer에는 50% glycerol, 1M Tris-HCl, 10%SDS, 2-mercaptoethanol, Bromophenol blue이 들어있다. 그 후 Protein boiling을95℃에서 5분간 시행한다.
▶ Results
▶ Date 2011. 5. 26
▶ Purpose : Western blotting
Gel electrophoresis를 통해 원하는 단백질을 분리한다. 분리한 단백질을 Nitrocellulose membrane에 transfer 시켜 1차 항체를 처리함으로써 immunoblotting을 준비한다.
▶ Principle
1. Western Blotting
Western blotting은 샘플로부터 특정 단백질을 detect하는 Analytical technique이다. gel electrophoresis를 사용하여 샘플에 섞여있는 단백질을 길이나 3차원 구조 등에 따라서 분리하여 PVDF나 nitrocellulose와 같은 membrane에 transfer시킨다. 단백질이 Transfer된 membrane에 얻고자 하는 단백질에 대한 antibody를 처리함으로써 detection한다. western blotting은 분자생물학, 생화학, 면역학 등 여러가지 분야에 사용된다.
이와 비슷한 원리를 이용, DNA detection은 southern blotting을 이용하며, RNA detection은 northern blotting을 이용하고, post-translational modification을 detection은 eastern blotting을 사용한다.
1) Transfer of protein to membrane
Constant current (200mA)를 가하는 이유는 Gel에 loading 되어있는 단백질이 membrane에 동시에 transfer되게 하기 위해서이다. Gel에 loading된 단백질은 작은 것일수록 gel의 아래쪽에 있고 저항(R)이 크며, 단백질이 클수록 gel의 위쪽에 있으며 저항(R)이 작다.
Transfer이 진행될수록 전해질이 점점 줄어들기 때문에 용액의 저항(R)이 높아지게 되어 열이 발생하게 된다. 이 때 단백질이 변성될 위험이 있으므로 얼음주머니를 transfer할 때 사용한 통에 얼음주머니를 넣는다.
2) Blocking
Skim milk를 처리하는 이유는 nonspecific한 milk protein을 이용하여 nitrocellulose membrane의 울퉁불퉁한 부분을 가림으로써 antibody의 specific binding을 확실히 하기 위해서이다.
