• 실험 준비물 : Ligation 혼합액, Competent cell, LB 용액, 42℃ water bath, Shaking
incubator, LB agar plate (Amp 50μg/ml – final conc)
실험에 사용할 competent cell을 얼음에서 약 15~20분 동안 녹인다.
Competent cell 200 ul를 각각의 DNA 혼합액에 넣어준 후 얼음에 약 30분간 incubation.
혼합액 tube를
및 Interphase가 잘 형성되게 해준다
Isoamyl alcohol
실험 시 거품이 생기는 거 방지 및 Interphase 형성 도움
Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1 또는
Phenol : Chloroform = 1 : 1 로 만들어서 사용
이 방법을 통해서 단백질 등을 한번 더 제거하여 순도 높은 DNA를 얻을 수가 있다
추 후 Purification 과정 필요
Low-melting temperature (LMT) – 저온에서 녹는 특별한 agarose사용
Electroelution – 전류를 통해 DNA를 분리하는 방법
1) Dialysis tubing : dialysis tubing 통해 DNA분리 방법
2) NA-45(nitrocellulose)membrane – Gel 조각에 NA-45membrane붙이고 전기장 주어 분리하는 방법
High-salt extraction – 고농도 Na+에 의해 agarose g
일반적인 경우에서 Blunt End ligation 불가
RNA 결합 불가
NAD+를 cofactor로써 사용.
일반적인 DNA cloning에는 사용하지 않음
특별히 cohesive end 만을 ligation 하고 싶을때, RNA ligation을 막고 싶을때 사용
Vector size : 2700bp(40ng/ul)
Insert size : 300(40ng/ul)
Vector와 insert의 길이 비 : 9
Vector 1ul 안의 DNA 몰수 : A
Insert 1ul