유전자를 vector에 삽입한다
Vector란?
DNA ligation과 restriction enzyme
T-vector를 이용한 PCR product의 cloning
3.유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입한다
Transformation
항생제와 LacZ를 이용한 selection
4.올바른 clone을 선택한다
PlasmidDNA 분리
Restriction enzyme mapping
DNA sequencing
Gene cloning의 결과
1.원하는 유전자
buffer는 gel이 살짝 잠길 정도로 붓는다.)
④ 2 µl의 100bp DNA ladder를 loading하여 DNA size marker로 사용한다.
⑤ 확인하고자 하는 plasmidDNA를 차례로 DNA loading buffer(1 µl)와 섞은 후, 각각의 well에 loading한다.
⑥ 75V 전압에서 전기영동을 하여, DNA가 충분히 분리되도록 한다. (Loading buffer의 이동위치 관찰)
재조합DNA를 시험관으로 이동: DNA 복제를 위한 효소 장치를 제공하는 숙주세포로 이동시킨다.
5. 재조합DNA가 들어 있는 숙주세포를 선택 또는 확인: 항생제 내성을 이용해서 원하는 유전자를 선별한다.
Ι. DNA sub-cloning 의 1단계 : 원하는 유전자를 분리한다
Principle
1. Genomic DNA의 분리
Bacterial cell
Plasmid에는 antibiotics resistance gene이 포함되어 있으므로 항생제가 포함된 배양접시에서 plasmid가 들어가지 않은 cell은 사멸하여 colony를 생성하지 못한다.(㉠ 제거)
3) Lac operon
박테리아에서 시행되는 유전자 발현 조절 기구 중 하나이며 E. coli가 lactose를 galactose와 glucose로 분해하는데 필요한 효소인 beta-gal