PCR product의 cloning
3.유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입한다
Transformation
항생제와 LacZ를 이용한 selection
4.올바른 clone을 선택한다
PlasmidDNA 분리
Restriction enzyme mapping
DNA sequencing
Gene cloning의 결과
1.원하는 유전자를 얻어낸다
유전자는 mRNA에서 얻을 수도 DNA에서 얻을 수도 있다. 이때RNA는 각
cell 배양물의 증식 및 수확을 한다. 이 방법은 bacteria를 배양한 뒤 centrifugation을 통해 cell의 pallet을 분리한다. 다음으로는 세포 추출물을 분리하는 단계인데 cell의 구성성분 중 필요 없는 부분을 부수어서 open시킨다. 그리고 세포 추출물로부터 DNA를 정제해야 하는데 이는 DNA를 제외한 RNA나 protein을 제거
DNA electrophoresis(agarose gel)
(1) 기본원리
DNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 기본원리를 갖는다. 이때DNA분자가 gel matrix사이를
buffer는 gel이 살짝 잠길 정도로 붓는다.)
④ 2 µl의 100bp DNA ladder를 loading하여 DNA size marker로 사용한다.
⑤ 확인하고자 하는 plasmidDNA를 차례로 DNA loading buffer(1 µl)와 섞은 후, 각각의 well에 loading한다.
⑥ 75V 전압에서 전기영동을 하여, DNA가 충분히 분리되도록 한다. (Loading buffer의 이동위치 관찰)