분야
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Principle
Reagent
Apparatus
Procedure
Result
Discussion
Subject: High performance liquid chromatography(이하 HPLC)
Purpose
Principle
• HPLC이란?
• HPLC의 구성
1. Eluent: 이동상(mobile phase, solvent)
2. Pump: 용매전달장치
3. Injector: 시료 주입기
4. Column: 분리장치
5. Detector: 검출기
6. Data Processing: 결과처리과정
• HPLC의 종류
1. 흡착크로마토그래피
2. 분배크로마토그래피
3. 이온교환크로마토그래피
4. 분자체작용
Reagent
Apparatus
Procedure
Result
• HPLC이란?
HPLC(High performance liquid chromatography)는 고성능액체크로마토그래피라고도 하는데 보통의 액체크로마토그래피(LC)와 기본적인 원리는 동일하지만 더 짧은 시간 내에 더 정밀하고 정확하게 시료를 분석할 수 있다. 또한 이 HPLC는 열적으로 안정하고 휘발성이 있는 시료만 분석가능하며 시분석 후 시료를 회수하는 것이 불가능한 GC(기체크로마토그래피)와 달리 적당한 용매에 녹는 물질이면 대부분 분석 가능하며 시료회수도 가능하여 여러 폭 넓은 분야에서 다양하게 사용되고 있다.
• HPLC의 구성
HPLC는 기본적으로 1.이동상(mobile phase, solvent), 2.시료주입기(injector), 3.펌프(pump), 4.컬럼(column), 5.검출기(detector), 6.결과처리장치(integrator, data system(PC))로 구성되어 있고 각 제조회사마다 조금씩 다를 수 있으나 기능은 같다.
1. Eluent: 이동상(mobile phase, solvent)
액체크로마토그래피에서 시료가 분리되는 원리는 이동상인 전개용매, 고정상인 컬럼의 특성, 시료의 성분들과의 interaction이기 때문에 이 용매의 선택이 매우 중요하다. 즉 분석 대상 물질에 따라서 용매를 선택하고 (단일, 혹은 혼합용매) 조성비율을 결정한다. 보통 사용되는 용매는 메탄올, 아세토니트릴, 물 등이있다. 모든 용매는 HPLC용 용매(물도 HPLC용 초순수 물)를 사용하는 것이 좋다.
2. Pump: 용매전달장치
펌프는 용매를 담고 있는 용기에서 (그림에서 eluent부분) 용매를 흡입해 injector에서 detector까지 밀어주는 역할을 한다. LC의 기기적 기능 중 핵심이라고 할 수 있으며, 이는 정량을 위해서 분리관을 통해 분리되어 나오는 물질 피크의 retention time이 정확해야 복잡한 피크들 중 분석대상물질을 찾을 수 있어 정성적인 확인 후에 상대적으로 정량을 할 수 있다. 이를 위해서 일정한 압력하에 일정하게 용매가 pump를 통해 injector, column, detector까지 흐를 수 있어야 결과에서 peak의 신뢰성을 높일 수 있다. 그러므로 pump는 일정한 유속과 압력으로 용매를 밀어 줄 수 있어야 하며 정확한 유량과 유속의 조절이 가능하여야 한다.
3. Injector: 시료 주입기
분석할 물질을 용매의 흐름에 연결시키는 역할을 한다. 즉 이동상에 시료를 loading하여 column을 보내는 장치인데 정확한 정량을 위해서 시료 주입시 정확한 양을 주입하는 것이 중요하다. 종류는 고정식루프식과 비고정식루프식, 또한 다량의 시료를 입력된 프로그램에 따라 자동적으로 주입해주는 자동시료주입기가 있다.
4. Column: 분리장치
컬럼은 충진물이 채워진 형태로 되어있으며 충진물의 종류에 따라 컬럼의 종류가 다양하다. 컬럼의 주기능은 충진물, 시료, 용매의 상호작용에 의해 혼합시료 속의 각 성분을 일정한 간격으로 분리하는 역할을 하여 물질의 실질적인 분리가 이루어지는 곳이며 많은 종류 중에서 사용할 컬럼의 선택의 요건은 분석대상 물질에 따라 다르다. 이 컬럼의 특성에 따라 시료가 분리되고 분석되므로 이에 따라 HPLC가 여러 종류로 나누어지며 각각의 HPLC의 원리가 이 컬럼의 특성에 있다고 할 수 있다. 분리관(고정상)의 충진물 특성(순상, 역상, 이온교환 컬럼 등), 충진물의 입자크기, 컬럼의 내경과 길이 등에 의해 분리능도 다양해진다.
우리의 실험에서는 역상컬럼을 사용하였다.
5. Detector: 검출기
컬럼을 통과하며 분리된 각 성분들은 detector를 거치면서 정량, 정성분석이 가능해진다. 검출기의 종류로는 자외선, 가시광선, 굴절률, 형광(fluorescence), Electrochemical 검출기 등이 있다. 분석하는 물질에 따라 어떤 detector를 사용할 지 선택해야 하며 감도가 높고 안정성이 있어야 한다. 컬럼을 통과한 용매에는 일정한 시간 간격을 두고 분리된 시료가 존재하게 되는데 이때 시료의 존재를 일정한 기작에 의해 인지하여 전기적 신호로 바꾸어 준다. 결구 검출기를 통과한 시료의 양에 따라 전기적 신호의 크기가 달라지게 되며, 이 신호의 크기가 시료를 정량하는 척도가 된다.
6. Data Processing: 결과처리과정
검출기에서 나오는 전기적 신호를 시간에 대한 신호의 크기를 받아 분리된 물질의 피크의 높이 및 면적 등으로 농도에 대한 상대적 결과가 나오는 장치이다. 컴퓨터와 연결되어 있어서 이 결과를 컴퓨터로 확인 할 수 있다.
검출기에서 나오는 전기적 신호에 의해 X축을 시간으로 Y축을 신호의 크기로 하며 chromatogram을 그려낸다. X축의 시간(retention time)은 기존에 알고 있는 표준 시료와 비교하여 정성분석에 사용될 수 있으며 Y축을 높이로 피크의 축을 밑변으로 한 피크의 면적은 정량 분석에 이용된다. Recorder는 단순히 피크를 그려내며 integrator등 data module은 피크에서 판단할 수 있는 정보를 자료화 해주는 역할을 한다.
• HPLC의 종류
HPLC의 종류는 column의 종류에 따라 흡착, 분배, 이온교환, 분자체작용크로마토그래피 등으로 나눌 수 있다.
1. 흡착크로마토그래피
정전기적인력 또는 수소결합 등의 작용으로 흡착력을 가지는 것에 따라 분류하는데 흡착제의 극성기에 비하여 극성차가 적은 화합물일수록 흡착제에 강하게 흡착되는 것으로 물질을 분리한다. HPLC에서는 실리카겔, 알루미나 등 극성이 큰 group을 가지고 있는 무기물을 흡착 충전제로 사용하여 분자내에 극성기를 갖는 화합물이나 전자적 편재성을 갖는 화합물에 대한 이동상 중의 용매분자와 고정상의 흡착작용이 서로 경쟁하여 시료는 흡착 이탈을 반복하면서 분리된다.
2. 분배크로마토그래피
일반적으로 용해도는 용질과 용매의 극성차가 적을수록 높고 극성차가 크면 낮다. 혼합되지 않고 공존하는 두 종의 용매에 용질을 용해한다면 용질은 각 상이 가지고 있는 용해도에 따라 용해되어 두 상에 분포 평형상태로
