분야
docx(1) Sample Preparation
Principle:
• Extraction Buffer(=lysis buffer) : Tris, TritonX-100, NP-40, SDS 등 여러 가지 detergent들이 cell wall과 mitochondria membrane을 깨트려주고 아래의 표에 제시된 protease inhibitors들이 세포 안의 protease가 단백질을 분해하는 것을 막아준다. 추가적으로 phosphatase inhibitor를 넣어 우리가 확인하려는 pERK의 activation 상태를 유지시킨다.
Procedure:
1. 쥐의 아세포에서 추출한 NIG-3T3 cell을 growing condition(10% Calf serum/ DMEM, 5% CO2, 36.5℃)에서 배양한다.
2. Suction pump로 배지를 제거하고 KRP Buffer를 사용하여 세포를 두 번 washing한다. insulin acute stimulation은 990㎕의 KRP와 10㎕의 insulin을 cell에 처리하여 37℃의 water incubator에 10분간 stimulation을 한다.
3. Suction pump로 KRP를 제거하고 ice cold PBS로 washing한다. 이는 세포의 대사를 멈추고 osmosis가 발생하지 않기 위함이다.
4. Cell extraction buffer 150ml를 세포 위에 뿌려주고 scraper로 긁어주어 화학적인 분해뿐만 아니라 물리적으로도 세포가 분쇄되도록 한다.
5. 이 세포 추출물들을 tube에 담아 centrifuge로 분리하여 상등액에 있는 단백질들을 추출.
