실험으로는 BGM cell을 sub cultre하고 seeding 한 후 virus를 감염시킨 BGM cell을 수거하여서 Cellharvest 후 Proteinsampling을 통해 단백질을 추출하고 정량했다.
먼저 Cellharvest로 배지를 e-tube에 수거한다. PBS 1.5ml씩 넣어 washing 하고 1ml PBS를 추가한다. 배지의 단백질을 제거하기 위해 washing을 꼼꼼히 해준다.
(
사용하였다.
세균에서 plasmid DNA를 추출하기 위한 방법은 배양된 세균을 centrifuge 한 후, Solution I, II, III를 넣어서 DNA를 분리 한다.
●Solution I
50mM Glucos ,25mM Tris-Cl, 10mM EDTA로 구성되어 있고, 세균을 resuspension 시키기 위해 사용하며 세포 표면을 약화 시킨다. Glucos는 cell의 삼투압 유지하는 역할을 한
sample에 계면 활성제(surfactant)가 조금이라도 존재하는 경우, 정량 값이 크게 영향을 받게 되는데, 이는 dye로 사용하는 Coomassie blue가 acidic하기 때문이다. 단백질에 따라 Coomassie dye와 결합하는 정도도 조금씩 다를 수 있으므로 주의가 필요하다. 이런 발색을 이용한 단백질의 정량은 시간이 지날수록 결과
protein을 E-tube 2set에 담는다. 그 후 sample buffer를 넣고 95도에서 5분간 끓어준다.
Result
(Protein determination)
다음은 단백질의 농도를 다르게 한 BSA standard의 O.D 측정값을 나타낸 표이며, 같은 농도와 조건의 tube를 2개씩 만든 뒤에 평균을 내서 결과값을 구하였다.
Conc.( μg/ml) Abs1 Abs2 Average
0 0.278
실험처럼 ...
4. Transfer: transfer를 준비하면서 gel을 장착시키게 되는데, 이 때 겔을 맨 손으로 만지게 되면 손에 있는 수 많은 종류의 protein이 gel에 묻어서 함께 transfer될 것이므로 주의한다.
우리가 사용한 기계는 (90V, 200 mA, 40 mins)이 아니라 60V, 350~300mA, 1h에서 최적의 transfer 결과를 보여주는 것이