![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-1](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0001.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-2](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0002.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-3](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0003.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-4](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0004.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-5](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0005.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-6](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0006.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-7](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0007.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-8](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0008.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-9](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0009.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-10](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0010.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-11](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0011.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-12](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0012.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-13](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0013.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-14](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0014.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-15](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0015.gif)
![[공학] 단백질 분리 정제 실험-특정단백질(p-ERK)가 phosphorylation 되었을 때 cell 내에서의 발현 정도-16](http://images.happyhaksul.com/thumb/548/547723-0016.gif)
분야
docx-실험 과정 discussion
-결과 discussion
▣ RESOURCES
Acrylamide Gel 만들기
Electrophoresis위한 kit 2개를 조립한다.
Separating buffer: 3.2ml DDW, 150.8µl 10% SDS, 5ml Acrylamide, 3.8ml separating buffer, 12.16µl TEMED, 3ml APS를 넣는다.
Stacking buffer: 4ml DDW, 75.4µl 10% SDS, 1.2ml Acrylamide, 0.8ml stacking buffer, 3.68µl TEMED, 1.4ml APS를 넣는다.
Separating gel을 만들어둔 kit에 먼저 넣고, 95% EtOH를 넣어 윗부분을 평평하게 만들어 준 후에 굳을 때까지 20분 정도 기다린다.
Separating gel이 굳으면 EtOH를 버리고 Stacking gel을 천천히 넣고 윗부분에 구멍을 내기 위해 comb을 끼우고 굳을 때까지 20분 정도 기다린다.
Stacking gel이 다 굳으면 comb을 빼고 유리 채 랩에 싸서 보관한다.
Protein determination
E-tube를 22개에 6개씩 2Set는 각각 protein sample 0, 1, 2.5, 5, 7.5, 10 ml 나머지5개씩 2set는 con1, con2, ins1, ins2, ins3으로 labeling후
DDW 95µl, 앞의 2Set에는 BSA standard 5µl, 뒤의 2Set에는 샘플 5µl를 넣고
마지막에 Bradford Solution 900µl을 넣고 총량 1ml를 만든다
각각 E-tube를 vortexing후 96 well plate에 200ul씩 넣고 O.D값을 측정한다
측정값을 이용하여 각각의 양에 맞게 protein을 E-tube 2set에 담는다. 그 후 sample buffer를 넣고 95도에서 5분간 끓어준다.
Result
(Protein determination)
다음은 단백질의 농도를 다르게 한 BSA standard의 O.D 측정값을 나타낸 표이며, 같은 농도와 조건의 tube를 2개씩 만든 뒤에 평균을 내서 결과값을 구하였다.
Conc.( μg/ml) Abs1 Abs2 Average
0 0.278 0.267 0.273
50 0.436 0.437 0.437
125 0.574 0.567 0.571
250 0.774 0.812 0.793
375 0.882 0.905 0.905
500 0.964 0.982 0.973
또한, (위에서부터) con1, con2, Ins1, Ins2, Ins3의 sample을 넣어준 각 2개씩의 tube로부터 얻은 수치의 평균값이다.
Sample abs Average
0.561 0.584 0.5725
0.612 0.619 0.6155
0.576 0.601 0.5885
0.598 0.637 0.6175
0.593 0.640 0.6165
만들어질 샘플의 총 단백질 질량 168.8 μg
Sample Abs(595nm) (μg/ml) μg/ul 80 필요볼륨 DDW
con-1 0.573 105.47 2.109 168.8 80 0
con-2 0.616 131.96 2.639 211.1 64 16
Ins1 0.589 114.95 2.299 183.9 73 7
Ins2 0.618 133.27 2.665 213.2 63 17
Ins3 0.617 132.61 2.652 212.2 64 16
각 Sample 조건 당 두 개씩 tube를 만들어서 595nm에서 측정된 샘플당 O.D값을 추세선에서 구한 공식에 대입하여 총 단백질의 질량을 알아보았다.
가장 낮은 농도인 sample tube의 농도 (168.8) 에 맞춰서 일정한 농도로 맞춰주기 위해 필요한 샘플의 양을 계산했다.
• http://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay
• http://blog.naver.com/deviliana?Redirect=Log&logNo=130033135401
• http://blog.naver.com/ckurapika0?Redirect=Log&logNo=10048124339
• http://www.thelabrat.com/protocols/BradfordReagent.shtml
• http://cafe.naver.com/goondae.cafe?iframe_url=/ArticleRead.nhn%3Farticleid=367387&
• http://www.google.co.kr/
