DNA를 취급하는 작업 전반에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.
◭ Principle
주형이 되는 double strand DNA의 표적 부분의 양끝 염기 배열 정보로부터 상류와 하류의 DNAprimer를 합성하고 내열성 DNApolymerase(Taqpolymerase)와 thermocycler를 이용해 PCR반응에 따른 특정 유전자 영역의 증폭을 실시한다. 이론적
DNA 산물의 비율이 증가하게 되므로, cycle의 후반부에 반응시간을 조금씩 늘려가는 것이 한 방법이다.
이러한 cycle을 반복하여 시행하며 원하는 DNA를 증폭시키는 것이 PCR의 원리이다. 보통 40cycle정도를 반복하고 그 이상 반복하게 되면 primer끼리 dimer를 형성하기 때문에 PCR의 의미가 없어지게 된다. PCR의
반응물 혼합 시에는 tube를 ice상에 두고서 혼합하여야 상온에서의 잘못 primerannealing에 의한 extension을 방지할 수 있다. 이론적으로 TaqDNApolymerase는 최적 온도 이하에서도 반응이 어느 정도 진행됨으로 상온 등에서 정확하게 annealing되지 않은 primer에 의한 임의의 반응이 진행됨으로써 원하는 size의 product
primer 쌍을 이용하는 것이 바람직하다. 보통 30초가량 지속되는 이 단계에서 시발체의 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작된다.
(3) DNA의 신장 (Elongation)
70°C ~ 74°C에서 시행하며 원하는 PCR산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq 중합효소는 보통 1분에
반응할 재료들이 바닥에 모이도록 한다.
9. 37℃(효소가 반응하기 가장 좋은 온도)에서 1시간(제한 효소에 의해 잘리기에 충분한 시간:1~2시간) 동안 반응시켜 DNA가 충분히 절단되도록 한다.
Agarose Gel Electrophoresis
1. 20ml의 1 x Tris Acetate EDTA 용액에 agarose 0.4g을 섞어서 2%로 만들고, 열을 가해 완전히 녹인