[분자생물학실험] Polymerase Chain Reation(PCR)
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분야
doc□ Principle
□ Reagents:
□ Apparatus:
□ Protocol for PCR reaction:
□ Results:
□ Discussion:
□ Summary:
□ Principle:
PCR cycle은 3단계로 구성된다.
① Denaturation: 95℃에서 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시킨다. 우리가 사용하는 polymerase는 Taq라는 온천에서 서식하는 균에서 추출하였기 때문에 높은 온도에서 활성을 띌 수 있다. 높은 온도일수록 single strand로 분리되기 쉽지만 아주 높은 온도에서는 polymerase가 활성을 잃으므로 95도씨가 적절하다.
② Annealing: 50~60℃에서 primer를 원하는 DNA의 특정 부위에 붙이는 과정이다. Tm 값(ssDNA와 dsDNA의 비율이 반반 정도 생기는 온도)의 근접한 곳에서 annealing temperature를 찾을 수 있다 Primer와 template의 G와 C 염기 사이에서는 3개의 수소 결합이, A와 T 사이에서는 2개의 수소결합이 생기기 때문에 G+C, A+T의 비율에 따라 Tm 값이 틀려진다. 따라서 G+C의 비율이 높아지면 annealing temperature를 높여주고 A+C의 비율이 높아지면 상대적으로 온도를 낮추어 annealing temperature를 찾으면 된다. Template의 중간에 primer를 붙이기 때문에 처음에 400bp의 크기를 가진 DNA들이 PCR을 거치고 나면 190~200bp로 그 크기가 감소한다.
③ Polymerization: 72℃에서 polymerase가 dNTP를 사용하여 DNA를 합성하는 과정이다. Polymerase의 활성에 따라 72℃에서 polymeration한다. Cycle이 계속되면서 효소의 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물의 비율이 증가하게 되므로, cycle의 후반부에 반응시간을 조금씩 늘려가는 것이 한 방법이다.
이러한 cycle을 반복하여 시행하며 원하는 DNA를 증폭시키는 것이 PCR의 원리이다. 보통 40cycle정도를 반복하고 그 이상 반복하게 되면 primer끼리 dimer를 형성하기 때문에 PCR의 의미가 없어지게 된다. PCR의 적용 범위로는 RFLP, STR, REP-PCR등이 있다.
□ Reagents:
