분야
doc◭ Subject
◭ Purpose
◭ Principle
1.dsDNA의 분리(denaturation)
2.Primer의 결합(annealing)
3.DNA의 합성(polymerization)
◭Material
Template DNA
Primer
dNTP(deoxynucleotide triphosphate)
10x PCR 완충용액
1.Magnesium:
2.KCl
3.Gelatin or bovine serum albumin(BSA)
Taq DNA polymerase
◭Procedure
◭Observation & Results
◭Discussion
◭ Subject
1. PCR(Polymerase Chain Reaction): DNA를 복제•증폭시키는 분자생물학적인 기술.
2. PCR이 끝나면 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 실시하여 반응산물을 확인한다.
◭ Purpose
PCR은 사람의 genome과 같이 매우 복잡하고, 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭한다. PCR과 여기서 파생된 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.
◭ Principle
주형이 되는 double strand DNA의 표적 부분의 양끝 염기 배열 정보로부터 상류와 하류의 DNA primer를 합성하고 내열성 DNA polymerase(Taq polymerase)와 thermocycler를 이용해 PCR반응에 따른 특정 유전자 영역의 증폭을 실시한다. 이론적으로는 반응 사이클의 2ⁿ으로 증폭이 가능하다. 증폭이 끝난 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수 있다. PCR을 통하여 in vitro 상에서 특정 부위의 DNA를 105~108배까지 수 시간 내에 증폭 시킬 수 있다.
-과정
1. dsDNA의 분리(denaturation)
90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시킨다. 높은 온도일수록 single strand DNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓴다. 첫 Cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5~10분 정도 시간을 주어야 한다.
2. Primer의 결합(annealing)
50°C∼65°C에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 아래의 표와 같다. 비 특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비 특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.
3. DNA의 합성(polymerization)
70°C∼74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.
위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.
PCR의 전 과정▶
◭Material
Template DNA
선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA(cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로, 가능한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안 된 경우에는 불순물의 양이 적을 때에는 반응이 충분히 일어나지 않고, 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다. Chromosomal DNA인 경우 1μg이내, plasmid DNA의 경우 100pg~100ng 정도를 일반적으로 사용하지만, 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비 특이 DNA가 나타나거나, band가 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.
Primer
Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다. G+C비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물 내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기 전에 신중히 고려해야 할 것이다.
dNTP(deoxynucleotide triphosphate)
시약상에서 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(각각 100mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20~200μM 정도를 사용한다.
