PCR을 하기위한 준비물
⑴ Template DNA : 증폭 대상이 되는 DNA.
⑵ 한 쌍의 primer : 증폭할 부분을 잡는 짧은 oligonucleotide.
⑶ dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 nucleotide.
⑷ Taqpolymerase : 유전자 합성효소. 효소이지만 열에 강하다.
5. PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점
⑴ Template DNA
PCR을 통하여 in vitro 상에서 특정 부위의 DNA를 105~108배까지 수 시간 내에 증폭 시킬 수 있다.
-과정
1. dsDNA의 분리(denaturation)
90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시킨다. 높은 온도일수록 single strand DNA로 잘 이행되지만 TaqDNApolymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮
DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.
TBE(Tris-borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
Procedure
Material & Equipment
Restriction enzymes(BamHI, NdeI), pET-14b, FabG gene이 inserted pET-14b plasmid, DDW , 10 x reaction buffer, 1 x TAE buffer, agarose, DNA ladder, DNA loading buffer
Pipette, binding column, spindown centrifuge
PCR (polymerase chainreaction)
PCR(polymerase chainreaction)은 1983년, K.B.Mullis가 고안한 것으로 특정염기서열을 증폭함으로써 DNA 염기서열 분석 및 현대 분사생물학의 발전을 가져왔다. PCR 방법에 가장 흔히 사용되는 DNA 중합효소(DNApolymerase)는 Taq 1 polymerase이다. 초기에는 E. coli polymerase를 사용하였으나 열에 불안
primer annealing에 의한 extension을 방지할 수 있다. 이론적으로 TaqDNApolymerase는 최적 온도 이하에서도 반응이 어느 정도 진행됨으로 상온 등에서 정확하게 annealing되지 않은 primer에 의한 임의의 반응이 진행됨으로써 원하는 size의 product 이외의 non-specific product가 만들어질 수 있다.
(2) Setting up the Laboratory