PCR을 하기위한 준비물
⑴ Template DNA : 증폭 대상이 되는 DNA.
⑵ 한 쌍의 primer : 증폭할 부분을 잡는 짧은 oligonucleotide.
⑶ dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 nucleotide.
⑷ Taqpolymerase : 유전자 합성효소. 효소이지만 열에 강하다.
5. PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점
⑴ Template DNA
PCR을 통하여 in vitro 상에서 특정 부위의 DNA를 105~108배까지 수 시간 내에 증폭 시킬 수 있다.
-과정
1. dsDNA의 분리(denaturation)
90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시킨다. 높은 온도일수록 single strand DNA로 잘 이행되지만 TaqDNApolymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮
DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.
TBE(Tris-borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
Procedure
Material & Equipment
Restriction enzymes(BamHI, NdeI), pET-14b, FabG gene이 inserted pET-14b plasmid, DDW , 10 x reaction buffer, 1 x TAE buffer, agarose, DNA ladder, DNA loading buffer
Pipette, binding column, spindown centrifuge
PCR (polymerase chainreaction)
PCR(polymerase chainreaction)은 1983년, K.B.Mullis가 고안한 것으로 특정염기서열을 증폭함으로써 DNA 염기서열 분석 및 현대 분사생물학의 발전을 가져왔다. PCR 방법에 가장 흔히 사용되는 DNA 중합효소(DNApolymerase)는 Taq 1 polymerase이다. 초기에는 E. coli polymerase를 사용하였으나 열에 불안
Polymerase chainreaction중합효소 연쇄반응(polymerase chainreaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다