[분자생물학실험] RFP-GST 단백질 분리 정제

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레포트 > 자연계열
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소개글

[분자생물학실험] RFP-GST 단백질 분리 정제에 대한 자료입니다.

목 차

1. 목적
2. 이론
3. 실험 기구 및 시약
4. 실험 방법

A. expression
B. Purification
C. Detection
D. 최종 준비할 샘플
E. SDS-Polyacrylamide gel 만들기.
F. SDS-Polyacrylamide gel의 구성(단위: ml)

5. 결과
6. 고찰

본문내용

그림 3] 원본사진
B.
위의 사진이 실험결과 최종적으로 나온 gel 사진이다. 아래 gel(왼쪽 모서리가 잘려있는 gel)이 2조의 결과물이며, 육안으로 밴드가 잘 보이지 않고, 7번 레인과 8번 레인에 있어야 할 밴드가 보이지 않아 사진의 contrast등의 조절을 통하여 보정을 해보았다.
C. 보정 후 사진
보정된 사진을 살펴보면 7번 레인과 8번 레인에 위치한 밴드가 보이는 것을 알 수 있다. 7번 레인에는 26kDa에 위치한(GST크기와 같은) 밴드가 하나 나왔고, 8번 레인에는 26kDa 뿐만 아니라 다양한 밴드가 검출되었다.

그림 4] 보정하는 것을 단계별로 나타낸 사진. 위가 가장 약한 보정이며, 차례대로 보정의 강도를 높였다.
6. 고찰
A. 일단 1번 레인부터 차례차례 확인을 해보자.
i. 레인 1번은 마커를 넣은 레인으로 밴드가 진한 부분이 위에서부터 70kDa, 25kDa를 나타낸다.
ii. 레인 2번은 GST만 넣은 레인이다. 25kDa를 나타내는 GST이외의 다른 밴드들도 함께 검출되었는데, 이는 GST속에 다른 단백질이 함께 들어있거나 단백질 자체가 분리되어 나타난 게 아닐까 추측한다.
iii. 레인 3번은 IPTG를 넣지 않은 레인으로 단백질 정제 중 물에 녹지 않는 pellet부분의 단백질을 추출해 전기영동을 한 것이다. 예상대로 박테리아에서 발현되는 다양한 단백질이 여과 없이 밴드로 나타난다. 물에 녹지 않는 단백질은 제 기능을 하지 못하는, 구조적으로 이상이 있는 단백질일 가능성이 많다.
iv. 레인 4번도 마찬가지로 IPTG를 첨가하지 않았지만 물에 녹는 단백질이 들어있는 상층액 부분을 추출해 전기영동 한 것이다. 단백질이 물에 녹는다는 것은 구조적으로 결함이 없는 단백질이라는 것의 가능성을 높여주며, 사진에서 보다시피 물에 녹지 않는 단백질인 3번 레인의 밴드보다 4번 레인의 밴드가 더 진한 것을 볼 수 있다. 박테리아가 구조적으로 결함이 없는 단백질을 더 많이 만든다는 말이기도 하지만, 한편으로는 3번과 4번 레인의 밴드가 왜 많이 차이 나지 않는가(구조적 결함이 있는 단백질이 왜 그렇게 많이 만들어지는가)에 대한 의문이 나올 수 있다.
하나의 이유를 생각해보면 박테리아의 주변 환경을 들어볼 수 있겠다. 일단 박테리아가 자라는 환경에서 스트레스가 지속되면 inclusion body가 생길 확률이 높아지며, 결국 이들이 모여 나중에 원심분리 결과 pellet으로 남는 것이다. 따라서 위에서 보이는 단백질을 만든 박테리아들은 비교적 큰 스트레스를 받았다고 추측된다.
v. 5번 레인은 IPTG를 넣었고, 그 중 pellet을 추출해 전기영동을 한 것이다. IPTG를 넣었으므로 GST-RFP 유전자가 발현할 수 있게 되고, 이로 인해 55kDa 근처의 밴드가 (진하게) 나타나게 된다. 사진을 보면 이 외의 다른 수많은 밴드들도 나타났는데, 이는 다른 박테리아의 단백질도 같이 나온 것으로 GST-RFP 발현된 단백질을 정제하지 않아 생긴 결과이다.
vi. 6번 레인 또한 IPTG를 넣은 것으로, 다만 이는 상층액을 추출하여 전기영동 한 것이다. 5번 레인과 별 차이를 나타내지 않는 것을 볼 수 있는데, 이는 미발현된 단백질이나 발현된 단백질 모두 그 양상이 크게 다르지 않다는 것을 의미한다. 다만 그 밴드 진하기는 약간 차이가 나는데, 이는 앞에서도 언급했듯이 박테리아의 주변 환경에 따라 나타나는 것으로 보인다. 6번 레인인 상층액, 즉 물에 녹는 단백질이 더 진한 밴드를 형성하여 이번에도 물에 녹지 않는 미발현 단백질보다 제대로 발현되는 단백질이 더 많다는 추측이 가능하게 된다.
vii. 하지만 7번 레인은 전혀 다른 양상을 보인다. 정제를 했으니 당연히 우리가 원하는 단백질인 GST-RFP를 제외한 박테리아의 다른 단백질을 나타내는 밴드는 보이지 않아야 정상이다. 하지만 실험 결과를 보면, 박테리아에

참고문헌

http://terms.naver.com/item.nhn?dirId=1701&docId=12936
그림 출처 - http://en.wikipedia.org/wiki/File:GST-wiki.jpg
http://en.wikipedia.org/wiki/Lac_operon

#RFPGST #단백질 #분자생물학실험 #RFP #분리

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