I. Protein Extraction – Micro Smash MS-100 equipment 사용
<실험 전 준비>
얼음(정사각형 스티로폼), E-tube 총 38개(8개×4세트->extract 옮길 것(sonication), centrifuge 상층액 뜰 것, 정량할 것, western 용/ 6개-> standard곡선 그릴 것), screw tube(cap-tube, 뚜껑 초록색) 8개
1. E-tube에 bead (큰 것 2개, 작은 것 10개) 넣어서 ice-rack에
Protein Quantity Method
◈ 단백질을 정량하는데 이용하는 spectroscopic 방법
à 단백질의 UV흡수에 따른 측정법
à Lowry assay
à Bradford dye assay
à the Smith copper/bicinchoninic assay(BCA assay)
☞ Lowry assay, Bradfordassay, BCA assay는 단백질에 따른
색변화를 일으킨다.
Absorbance at 280nm(A280)
1. 정량 원리
protein complex의 푸른 형태를 측정하는데 최적의 파장이 된다. 575nm~615nm사이의 어느 파장에서든 blue form을 측정할 수는 있지만 595nm에서 측정한 것보다 측정되는 흡광도 값이 10%정도 낮아지게 된다.
- Bradfordproteinassay에서 Coomassie dye ligand는 단백질의 positive charged된 부분에 결합하기 때문에 basic amino acid인
1. Title : Cell harvest & Protein sampling
2. Objective : 크기에 따라 단백질을 분리하는 SDS-PAGE를 하기위해서 poliovirus에 감염된 BGM cell을 용해시킨 후, 단백질을 추출하고 정량한다.
3. Method
1) Cell harvest
① 배지를 e-tube에 수거한다.
② PBS로 washing 하고 1ml PBS를 추가한다.
③ Scraper로 긁어 모아 e-tube에 담는
등이 있다.
2. 단백질 정량법이란 무엇인가?
단백질 농도를 정량하는 방법에는 UV법, Lowry법, BCA법, Bradford법 등이 있다. 각각의 감도, 간편함, 단백질의 종류에 의한 감도의 차이, 방해물질의 종류와 허용농도 및 반응액의 PH등에 차이가 있으므로 측정한 대상에 따라 적당한 방법을 선택하여야 한다.