cation의 높은 농도에 노출시키면, 일부 cell들은 이해되지 않은 메커니즘에 의해 외부 DNA를 받아들일 수 있게 된다. 전형적인 경우에 E.coli cell들은 CaCl2로 처리되고 플라스미드 vector와 섞인다. 보통 10000개의 cell들 중에 하나의 cell만이 외부 DNA를 받아 들일 수 있는 competent한 상태가 된다. 각각의 competent cel
1. 정확한 위치에서의 DNA 절단: 염기서열에 특이적인 restriction endonucleases는 클로닝에 필수적인 분자 가위 역할을 한다
2. 자기 자신을 복제할 수 있는 작은 DNA 분자를 선택: 이러한 DNA를 cloning vector라고 한다. Vector는 운반체이며 전형적으로 플라스미드 또는 바이러스의 DNA가 있다.
3. 두 DNA 조각을 공유
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Gel Purification
1. UV로 확인한 Agarose gel의 DNA band를 잘라서 각각 1.5ml microcentrifuge tube에 넣어 무게를 잰다(pET-14b, FabG).
2. 빈 tube의 무게와 1.에서 잰 무게의 차를 이용하여 gel의 무게를 정한다.
3. Gel의 3배 만큼의 Gel binding Buffer를 첨가한다.(gel을 녹인다)
4. 60℃에서 10분간 incubation하고 2~3분마다 vortex
1. DNA를 자른다는 것은 nucleotide를 연결하고 있는 phosphodiester bond를 끊어여러 DNA 단편을 만들어 내는 것을 의미한다. 이 때, 이런 역할을 하는 효소를nuclease라고 하며 그 종류로는 바깥 쪽을 절단하는 효소인 exonuclease와 안쪽을 절단하는 endonuclease가 있다.
2. 대표적 endonuclease인 제한효소(restriction enzyme)는
Subject : DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자를 분리한다.
Purpose: DNA sub-cloning에 사용할 원하는 유전자를 만들기 위해 plasmid(vector)내에 restriction enzyme을 사용하여 DNA를 자르고 원하는 유전자를 삽입한 후, 목적하는 유전자가 정확하게 cloning되었는지 DNA 전기영동 결과를 분석하여 확인할 수 있