1. 제목( Subject ) : PlasmidDNA purification and 전기영동(Electrophoresis)
2. 실험목적(purpose)
미리 배양된 E.coli를 plasmidDNA를 purification 하고 이것을 Agarose Gel 전기영동을 통해 분리하여 확인한다.
3. 재료 및 기구 ( Material and Apparatus )
pippet, plasmidDNA, rack, pippet tip, centrifuge(미량원심분리기), 전기영동장치, comb, LB(
실험할 때 쓰게 될 restriction enzyme은 BamHⅠ 부위와 NdeⅠ 부위를 자른다. (왼쪽 그림은 Restriction enzyme cut sites )
2) DNA electrophoresis(agarose gel)
(1) 기본원리
DNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고
DNA와 같이 전기영동 될 때, DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
③ 전기영동 buffer
TAE (Tris-acetate EDTA):DNA분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis 에서 쓴다.
TBE (Tris-borate EDTA):DNA분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
4. Materials & Equipments
Restriction enzymes(BamHⅠ, NdeⅠ), pET-14b plasmid, FabG gene
DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
c. 전기영동 buffer
TAE(Tris-acetate EDTA) : DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.
TBE(Tris-borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
Procedure
Material & Equipment
Restriction enzymes(BamHI, NdeI), pET-14b, FabG gene이 inserted pET-14b plasmid, DDW , 10 x r
PlasmidDNA 분리
Restriction enzyme mapping
DNA sequencing
Gene cloning의 결과
1.원하는 유전자를 얻어낸다
유전자는 mRNA에서 얻을 수도 DNA에서 얻을 수도 있다. 이때 RNA는 각 장기마다 발현하는 정도가 다르므로 반드시 내가 원하는 유전자가 많이 발현하는 곳에서 유전자를 얻어야 한다. 그리고 실험 하는 종에