Transformation의 원리
E.coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데, 이러한 과정을 transformation이라 하며 다음과 같은 단계를 거쳐 이루어진다. E.coli cell이 DNA를 uptake 할 수 있는 상태(competent)로 만들어 주기위해 E.coli cell을 Ca과 같은 multivalent ion의 존재 하에 0℃에서 incubation한다. 이때, cation은 E.coli cel
multivalent ions of organic solvents, 및 detergent 순도등에 의해 좌우된다. 그리고 특성에 따라 detergent는 ionic detergent, non-ionic detergent, 및 zwitterionic detergent로 나눌 수 있다. Ionic detergent는 SDS, LiDS, DOC 등과 같은 cationic 및 anionic detergent로 다시 나뉘며 이들은 highly denaturant로 monomeric protein으로 단백질을 분리시키는 특
◎ Reporter Gene
형질전환을 한 후 실험자가 쉽게 자신의 형질전환체를 확인할 수 있게끔 만들어 주는 유전자를 말한다. Reporter Gene 사용하는 목적은 우선 형질전환된 유전자가 발현되었는지의 유무와 두 번째로 어느 정도의 양으로 발현되었는가 알아보기 위한 것이다. Reporter Gene으로 사용되는 것들은 G
light chains: 40 V x 5 J = 200
light chains: 30 V x 4 J = 120
H chains: 40 VH x 27 DH x 6JH = 6,480
320 L chains x 6,480 H chains = 2.1 x 106
Junctional diversity (addition or deletion of nucleotides at recombination sites, especially of H chain), estimated to add 3x107 fold to overall diversity.
Recombination signals
Rag-1/Rag-2/Artemis
Experiment 1:
DNA sub-cloning
Purpose
Day 1:
DNA sub-cloning의 1단계: 원하는 유전자를 분리한다.
유전자를 복제하기 위해서는 우선 bacterial cell로부터 DNA를 분리해내고, 그로부터 원하는 유전자를 잘라내야 한다. 이와 같이 이 실험에서는 DNA sub-cloning의 첫 단계로서 원하는 유전자를 분리해내는 단계를 수행
1. 정확한 위치에서의 DNA 절단: 염기서열에 특이적인 restriction endonucleases는 클로닝에 필수적인 분자 가위 역할을 한다
2. 자기 자신을 복제할 수 있는 작은 DNA 분자를 선택: 이러한 DNA를 cloning vector라고 한다. Vector는 운반체이며 전형적으로 플라스미드 또는 바이러스의 DNA가 있다.
3. 두 DNA 조각을 공유
2. 제한효소(restriction enzyme)에 의한 유전자의 분리
유전자 클로닝은 DNA분자를 아주 정확하고 반복적으로 절단할 것을 요구한다. 각 Vector 분자의 circle을 열어서 새로운 DNA가 삽입될 수 있도록 각 분자마다 하나의 같은 위치가 절단되어야 한다. DNA를 자른다는 것은 nucleotides를 연결하고 있는 phosphodiester b
1. DNA를 자른다는 것은 nucleotide를 연결하고 있는 phosphodiester bond를 끊어여러 DNA 단편을 만들어 내는 것을 의미한다. 이 때, 이런 역할을 하는 효소를nuclease라고 하며 그 종류로는 바깥 쪽을 절단하는 효소인 exonuclease와 안쪽을 절단하는 endonuclease가 있다.
2. 대표적 endonuclease인 제한효소(restriction enzyme)는
Subject : DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자를 분리한다.
Purpose: DNA sub-cloning에 사용할 원하는 유전자를 만들기 위해 plasmid(vector)내에 restriction enzyme을 사용하여 DNA를 자르고 원하는 유전자를 삽입한 후, 목적하는 유전자가 정확하게 cloning되었는지 DNA 전기영동 결과를 분석하여 확인할 수 있
1. Date
Day 1 – 2008년 10월 27일 월요일
2. Subject & Purpose
Digestion of DNA with Restriction Enzyme & Agarose Gel Electrophoresis & Gel Purification
Plasmid pET vector와 FabG gene이 insert된 pET vector를 두 가지 제한효소, BamHⅠ과 NdeⅠ으로 자른 다음 전기영동을 통해 결과를 확인하고 Purification을 한다.
3. Principle
1) Restriction enzy