- 정제과정
플라스미드의 정제는 total cell DNA의 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라
가장 보편적으로 사용되는 방법
SDS와 NaOH를 이용해서 cell을 깨고 chromosomal DNA와 protein등을 denaturation 시킴
High pH : DNA가 base pairing을 못함
Plasmid의 경우 작고 CCC form 이기 때문에 완전히 나눠지지 못함
pH가 정상으로 돌아오면, chromosomal DNA는 Protein등와 함께 침전되고 Plasmid는 상층액에 속함
Phenol
Alkaline lysis method
- 세포의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA만을 분리하는 방법
- Chromosomal DNA 와 plasmid의 고유한 형태 구조 차이를 이용 !
; Chromosomal DNA - 상대적으로 size가 크고, double heilx
Plasmid - size가 작고, supercoiled 형태 -> pH에 변화에 의한 변성↓
Alkaline Lysis Method
DNA gel electrophoresis(전기영동)
- DN
Transformation한 후의 결과는 다음 세 가지 중의 하나로 생각할 수 있다.
㉠ Plasmid가 들어가지 않은 경우
㉡ Plasmid가 들어갔으나 plasmid에 원하는 gene이 들어가지 않은 경우
㉢ 원하는 gene이 포함된 plasmid가 들어간 경우
Plasmid에는 antibiotics resistance gene이 포함되어 있으므로 항생제가 포함된 배양
1. Date
Day 1 – 2008년 10월 27일 월요일
2. Subject & Purpose
Digestion of DNA with Restriction Enzyme & Agarose Gel Electrophoresis & Gel Purification
Plasmid pET vector와 FabG gene이 insert된 pET vector를 두 가지 제한효소, BamHⅠ과 NdeⅠ으로 자른 다음 전기영동을 통해 결과를 확인하고 Purification을 한다.
3. Principle
1) Restriction enzy
Subject : DNA sub-cloning을 위해 원하는 유전자를 분리한다.
Purpose: DNA sub-cloning에 사용할 원하는 유전자를 만들기 위해 plasmid(vector)내에 restriction enzyme을 사용하여 DNA를 자르고 원하는 유전자를 삽입한 후, 목적하는 유전자가 정확하게 cloning되었는지 DNA 전기영동 결과를 분석하여 확인할 수 있
plasmid라는 기생인자에 삽입하여 cloning을 하여야 한다. 자유롭게 증식할 수 있는 능력을 가진 plasmid의 일부에 목적으로 하는 DNA를 삽입하고 숙주 세균세포에 도입하면 삽입한 DNA는 숙주 세균과 함께 증식하므로 단일의 DNA를 다량으로 얻을 수 있으며, cloning에 이용되는 plasmid를 vector라 한다.
이번 1,2주
2R-1. 원핵세포에서 Chromosomal DNA와 Plasmid DNA의 형태학적인 차이점을 설명하라.
1) Chromosomal DNA 의 구조
: 원핵세포의 chromosomal DNA는 불규칙한 모양으로 핵양체(nucleoid)라는 부분에 모여 있다. 대부분의 원핵세포는 단일한 고리 모양의 이중나선 DNA(deoxyribonucleic acid)를 지니지만 어떤 세균은 선형 DNA를 염색
1. DNA를 자른다는 것은 nucleotide를 연결하고 있는 phosphodiester bond를 끊어여러 DNA 단편을 만들어 내는 것을 의미한다. 이 때, 이런 역할을 하는 효소를nuclease라고 하며 그 종류로는 바깥 쪽을 절단하는 효소인 exonuclease와 안쪽을 절단하는 endonuclease가 있다.
2. 대표적 endonuclease인 제한효소(restriction enzyme)는